细胞培养实验室常见问题

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1、细胞培养实验室常见问题1.如何选用培养基？培养某-类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199屮同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养，各种目的无血清培养的首选是AIMV培养基（SFM）。2.为什么要热灭活血清？加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在进行免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。3.L一谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定

2、吗？L一谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L一谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L一谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没冇最终确定。L一谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。4.GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I?这个二肽有多稳定？GlutaMAX-1二肽是L一谷氨酰胺的衍生物，将其不稳定的u—氨基用L一丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放L一谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-T二肽非常稳定，即使在121磅火菌2

3、0分钟，GlutaMAX-T二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L一谷氨酰胺几乎完全降解。5.为什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研宄表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研宂人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。6.如何用台盼兰计数活细胞？用无血清培养基把细胞悬液稀释到200-2000个/毫升，在0.1毫升的细胞中加入0.1毫升

4、的0.4%的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色的细胞是死细胞。7.如何消除组织培养的污染？当重要的培养污染时，研宄者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对-些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下而是推荐的确定毒性水平和消除培养污染

5、的实验步骤。1）在无抗牛.素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。2)分散细胞悬液到多孔培养板中，或儿个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0,2.0，4.0,8.0mg/ml。3)每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。4)确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2-3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2—3代。5)在无抗生素的培养基中培养细胞一代。6)重复步骤4。7)在无抗生素的培养基中培养4一6代，确定

6、污染是否以已被消除。1.培养基屮丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源。尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。2.Hank’s平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要C02培养箱。原因是什么？Hank’S平衡盐溶液(HBS)和Earle’S平衡盐溶液(RBS)有什么本质的功能差别？HBS和EBS的主耍差别在于碳酸氢钠的水平，碳酸氢钠的含量在Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的C02平衡，以维持溶液的PH

7、值。Eagles液在空气水平的C02中，溶液会变碱，Hanks液在C02培养箱中会变酸。如果希望在C02培养箱中保存组织，需要用Eagles液。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。3.Qualified和Certified胎牛血清有什么差别？Certified胎牛血清包括了Qualified胎牛血清执行的所有的标准检验程序，而且除了这些标准检测，Certified胎牛血清还有如下一些附加的检测：End-PointDeterminationofEndotoxinContent噬菌体检验生物化

8、学检测激素的检测血红蛋白检测Sf9细胞生长促进及方法学检测4.二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入m)TA的R的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。5.制备lip