pcr和dnp标记核酸探针检测禽源沙门氏菌四环素

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1、PCR和DNP标记核酸探针检测禽源沙门氏菌四环素【摘要】目的观察利用PCR和DNP标记核酸探针检测禽源沙门氏菌四环素耐药性基因tetC。方法通过对临床分离并经生化实验和血清学试验鉴定的11株禽源沙门氏菌和1株标准株C79-13进行药敏试验。结果有11株有高耐药性，另外1株有低耐药性，耐药率达100%；对其四环素耐药基因tetC进行了扩增，结果获得以质粒为模板的特异性产物，与药敏试验符合率为100%；用DNP标记其PCR产物，制成DNA探针，采用菌落杂交方法对12株沙门氏菌菌落进行杂交。结果显示：与PCR结果的阳性符合率为90

2、.2%，具有很高的特异性。结论利用PCR和用DNP标记的这种探针检测四环素耐药基因tetC具有很高的敏感性和特异性，从而为禽类沙门氏菌的耐药性检测提供了高效敏感的手段。【关键词】沙门氏菌；四环素耐药基因；TetC；PCR；核酸探针Studyondetectionoftetracyclineresistancegene(tetC)ofavianpathogenicSalmonellabyPCRandDNPlabelednucleicacidprobe【Abstract】ObjectiveByusingclinicalisola

3、tesandbiochemicalandserologictestsdetectionon11avianSalmonellastrainsandonestandardSalmonellaC19-13,thedrug-susceptibilitytestshoplifyingthetetracycline-resistancegene,itproducesspecificmaterialbyplasmidspleteandtheconcordanceratetodrug-susceptibilitytestis100%.Byu

4、singthemethodofprobingthetetCgenelabeledethodofPRCshoethodstodetectthedrug-resistanceofavianSalmonella.【Keyonella;tetracycline-resistantgene;tetC;PCR;nucleicacidprobe饲料中添加四环素类药物和临床上大量滥用四环素类药物，被认为是引起病原菌的耐药性大量产生的原因［1］。四环素类药物早在20世纪60～70年代就已广泛应用，尤其在兽医的临床上更是如此，所以导致细菌对四环

5、素类的耐药性颇为严重，我国的情况更是如此。抗生素的选择性压力、外源性耐药质粒的获得、耐药质粒及转座子在肠道菌间的传递等是耐药菌株产生和不断增多的主要原因，四环素耐药性的产生常常是由于获得了有关接合质粒或转座子中新的四环素耐药基因tet。另外，沙门氏菌还可以感染人和其他动物，耐药性的研究，是关系到兽医、食品卫生和人类健康的严肃的问题，绝不能掉以轻心。本文就禽源沙门氏菌的耐药质粒的四环素耐药基因tetC进行了分子生物学水平诊断方面的研究。1材料与方法1.1材料1.1.1菌株沙门氏菌标准株：C79-13(购自中国兽药监察所),药敏

6、质控菌ATCC25922(购自生物制品监察所)，临床上经分离培养并经细菌学和生化及血清学鉴定的禽源沙门氏菌11株(西南民族大学生命科学与技术学院禽病研究所分离)。1.1.2培养基及常规化学药品和试剂四环素、金霉素、土霉素、强力霉素药敏纸片(购自北京天坛药物生物技术开发公司)；四硫磺酸钠煌绿增菌培养基、亚硒酸盐胱氨酸增菌培养基、SS培养基、三糖铁琼脂培养基、LB培养基(由国产试剂自配)；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管（购自杭州天和微生物试剂有限公司）、沙门氏菌属诊断血清试剂盒（购自成都生物制品研究所）。1.1.3分子生物学试剂和用

7、品100bpDNAMarker、PBR322、PUC18、TaqPCR试剂盒（购自天为时代科技有限公司）；Biospin胶回收试剂盒（购自BioerTechnology有限公司）；带正电尼龙膜、硝酸纤维膜、杂交袋或杂交瓶、紫外交联仪（购自华美公司）；暴光盒（购自粤华公司）；胶片（购自柯达公司）；鲑鱼精DNA、电泳级琼脂糖（购自宝生物工程有限公司）；质粒小提量试剂盒（购自OMEGA生物科技公司）；TAE自配；HybQUESTpleteSystem(购自美国Mirus生物公司)；X-ray光机(上海讯星电子科技公司)。1.2方

8、法1.2.1病原菌的临床分离和鉴定对于临床上的疑似沙门氏菌病例，经无菌接种和四硫磺酸钠煌绿培养基增菌培养以及SS培养和三糖铁培养，再经生化和血清学鉴定以确定沙门氏菌。具体方法见试剂盒说明书和1.00agattgtcacgaccacatcatcRIGHTPRIMER2260.1645.453