猪传染性胃肠炎病毒HX株的分离与鉴定及其PL蛋白对抗IFN-β的分子机制

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1、摘要摘要猪传染性胃肠炎病毒（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓｏｆｓｗｉｎｅ，ＴＧＥＶ）是引起猪传染性胃肠炎（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ，ＴＧＥ）的病原。临床方面表现为严重脱水、呕吐和水一样腹泻，是种高度接触性和急性传染病，。各年龄段的猪对ＴＧＥＶ都易感特别能够引起两１周龄以下的仔猪死亡，致死率为００％。ＴＧＥ流行范围非常广，发病率和致死率极高，是我一国和其他国家仔猪死亡的重要疫病之，并且给养猪业造成了严重经济损失。本实验从黑龙江省哈尔滨

2、市周边某猪场收集腹泻仔猪的粪便通过ＴＧＥＶ的Ｎ基因引物一进行ＲＴ－ＰＣＲ鉴定Ｐ，扩增到段约ｌｌＯＯｂｐ的基因序列，同时用ＰＲＲＳＶ、ＥＤＶ和ＰＲＶ的－引物进行特异性实验没有扩增到目的基因，将扩增得到的目的基因与ＭＤＴ载体连接后Ｐ１８进行测序分析，结果表明该基因序列与ＴＧＥＶ核苷酸序列相似性为９８．５％，这说明腹泻仔猪２５的粪便中含有ＴＧＥＶ，０．２ｉｍ过滤。将该粪便病料经适当离心｜后接种ＰＫ１细胞。经过盲传８代后细胞出现典型病变，利用透射电镜观察确定该病毒的形态是有囊膜的冠状病毒，直径？ＴＧＥＶ－大小在８０１

3、００ｎｍ，将该病毒分离株命名为ＨＸ株。分别设计１０对引物对ＨＸ株进行全基因组测序，可以成功拼接成２８５８０ｂｐ，基因姐上依次为’’－－－－－－－－－ＯＲＦ－５ＵＴＲｌａＯＲＦｌｂＳＯＲＦ３ａＯＲＦ３ｂＥＮＯＲＦ７３ＵＴＲ。与国内分离株同源性很高，遗传一进化树分析显示ＨＸ株与Ｐｕｒｄｕｅ在同个进化分支，与疫苗株Ｈ１６５进化关系较远。一固有免疫是宿主抵御微生物入侵的第道防线，主要过程分为干扰素（ＩＦＮｓ）合成通路ｓ，丨ＦＮｓ与相应受体结合ＪＡＫ／ＳＴＡＴ途径，和ＩＦＮ信号通路后激活，进而激活丨ＳＧｓ产生最终导致

4、抗病毒感染平台产生－ＴＧＥＶＨＸ分不同时间段分别感。本实验通过利用ＴＧＥＶＨＸ和ＵＶ－－－ＰＫ１５Ａ后ｌ－１染，收集细胞后提取总ＲＮＲＴＰＣＲ方法检测ＩＦＮｃｔ，ＩＦＮ，ＩＬ６，丨Ｌ２，，采用ｑＰＴＮＦ－－ｃｔ，ＩＲＦ７，Ｍｘｌ，１ＳＧ５６，ＳＴＡＴ１和ｐａｃｔｉｎ的转录水平，进而分析ＴＧＥＶＨＸ与固有免疫－－细胞因子之间的相互关系。结果发现ＴＧＥＶＨＸ能够通过其自身复制抑制ＩＦＮａ，Ｉ，ｌＦＮｐＴＮＦ－ｃ－ｔＩＲＦＩＳＧ，６，ＩＵ２ＳＴＡ１，而，７和５６的转录对于ＩＬ和Ｔ转录水平与ＵＶＴＧＥ

5、Ｖ相当ＴＧＥＶ能够诱导高水平的Ｍｘｌ基因转录。这说明ＴＧＥＶ利用其自身复制调节细胞因子的转录，进而完成病毒复制和传播。所有冠状病毒都编码木瓜样蛋白酶（ＰＬ），负责将病毒早期ＯＲＦ１合成的多聚蛋白切割－开来ＳＡＲＳ，ＮＬ６３，ＰＥＤＶ和ＭＨＶ中都发现ＰＬ蛋白有抑制ＩＦＮ，是病毒复制必需基因。Ｐ通路的作用，而ＴＧＥＶ也存在ＰＬ蛋白，且晶体结构分析表明ＴＧＥＶＰＬ与ＳＡＲＳＰＬ结构相－似，说明存在相似的功能。本实验研宄发现ＴＧＥＶＰＬ蛋白能够抑制ＩＦＮＰ的合成并且不依赖于其催化活性。ＰＬ能够定位于线粒体中不

6、能影响ＳＴＩＮＧ形成的二聚体，但是具有去泛素化功能能够将ＲＫＭ和ＳＴＩＮＧ蛋白去泛素化阻止向下游信号转导。综上，本实验成功分离ＴＧＥＶ地方流行毒株ＴＧＥＶ，对该病毒的流行病学、实验ＨＸ株室诊断和病毒的生物学特征进行研究；ＴＧＥＶＨＸ能够通过自身复制调节宿主细胞因子的转录从而有利于自身复制－；ＴＧＥＶＨＸＰＬ能够通过去泛素化功能抑制ＩＦＮＰ的产生。关键词猪传染性胃肠炎病毒；分离；鉴定；固有免疫；ＰＬ蛋白；去泛素化ＩＡｂｓｔｒａｃｔＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＰｏｒ

7、ｃｉｎｅＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓＶｉｒｕｓＨＸＳｔｒａｉｎ＆ＭａｃｈｎｉｓｍｏｆＰＬＰｒｏｔｅｎｔａｎａｔＩＦ－ｉｎＡｇｎｉｚｅｔｈｅＳｉｇｌｉｎｇａｈｗａｙｏｆＮｐｐＡｂｓｔｒａｃｔＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓｏｆｓｗｉｎｅ（ＴＧＥＶ）ｉｓａｎｅｎｖｅｌｏｅｄｖｉｒｕｓａｎｄｂｅｌｏｎｓｔｏａｇｐｇｍｅｍｂｅｒｏｆｒｏｕｓｏｆｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｅｓ，ｗｈｉｃｈｉｓｏｎｅｏ

8、ｆｔｈｅｍｏｓｔｉｍｏｒｔａｎｔｃａｕｓａｔｉｖｅａｅｎｔｓｏｆｅｎｔｅｒｉｃｇｐｐｇｉｌｌｉｈｈｉｉｎｆｅｃｔｉｏｎＴｈｉｔｉｉｉｔｉｔｈｈｈｍｏｂｉｄｉｔｉｉｌｆａａｔｈ．ｅｎｆｅｃｏｎｓ