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《磁分离酶联免疫荧光法（meif）检测人血清中胰岛素》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、磁分离酶联免疫荧光法（MEIF）检测人血清中胰岛素：谢晶,刘振世,胡珊,蔡汝秀,杨海,杨祥良【摘要】 目的:采用磁微粒分离酶联免疫荧光（MEIF）分析技术建立一种简便、高敏感性、定量检测人血清胰岛素(insulin)的新方法。方法:选用2株识别人胰岛素不同表位的单克隆抗体(mAb)。一株mAb用异硫氰酸荧光素（FITC）标记,另一株用碱性磷酸酶(AP)标记;偶联羊抗FITC抗体的磁珠用作固相分离载体,4-甲基磷酸伞型酮用作荧光底物。结果:成功建立了定量检测人血清胰岛素的MEIF,灵敏度2.0μIu/mL,线形范围0～188.52
2、μIu/mL,批内变异系数(CV)为4.3%～5.2%,批间CV为2.6%～9.5%,稀释回收率为93%～117%,加标回收率为94%～113%。实际样品的测定结果与倍爱康公司商品化人insulin磁分离发光系统检测试剂盒的检测结果比较,具有良好的相关性。结论:MEIF定量测定人insulin方法成本低、灵敏度高、稳定性好,在临床免疫检测领域具有广阔的应用前景。【关键词】酶联免疫分析免疫荧光4-甲基磷酸伞型酮磁珠胰岛素 ［Abstract］AIM:Toestablishaconvenientandsensitivemagicse
3、parationenzymeimmunofluorescence(MEIF)methodfordetectinghumaninsulin.METHODS:Tonoclonalantibodies(mAbs)agicsolidphaseseparation.Magicbeadsbelliferyl-phosphoricacid(4-MUP)L,thelinearrange0μIu/mLto188.52μIu/mL,andtheintra-assayvariationandinter-assayvariationagicenzymec
4、hemiluminescenceimmunoassaysystem.CONCLUSION:TheMEIFfordetectinginsulinislomunedetection. ［Keyeimmunoassay;immunofluorescence;4-Methylum-belliferyl-phosphoricacid;magicbeads;insulin 糖尿病是我国最常见的内分泌疾病,发病率约为1.3‰,我国每年约有2.7万新增患者。糖尿病给患者家庭和社会带来巨大的经济损失（每年高达100亿人民币）和沉重的精神伤害［1
5、］。随着人们生活水平的提高和生活方式的改变,糖尿病发病趋于年轻化［2］。血清胰岛素（insulin）含量测定是糖尿病诊断和治疗过程中重要的血清检查项目,对于糖尿病的诊断和治疗具有重要意义。常规检测胰岛素的方法主要有放射免疫法和酶联免疫吸附法等,但存在着放射污染或灵敏度低,操作复杂等不足。本研究旨在建立一种检测人血清胰岛素的新方法-磁分离酶免疫荧光法(magicenzymeimmunofluorescence,MEIF),实现对人血清胰岛素的定量、敏感和快速检测。 1材料和方法 1.1材料4-甲基磷酸伞型酮（4-MUP）购自Si
6、gma公司。磁分离试剂、洗液、胰岛素标准品及抗人胰岛素单克隆抗体（mAb）FITC和AP连接物由北京倍爱康生物技术有限公司提供。二乙醇胺（DEA）和三乙醇胺（TEA）购自Fluka公司。VictorⅢ型荧光检测仪为珀金埃尔默(PerKinElmer)公司产品。专用于酶标板的磁分离器为自行研制。恒温箱为上海实验仪器公司产品。白色未标记酶标板为GreinerMicrolon生产。 1.2方法 1.2.1mAb标记物的工作浓度选择将倍爱康公司提供的FITC标记抗人胰岛素mAb1和AP标记mAb2,用TRIS缓冲液稀释至不同浓度,以检
7、测灵敏度高、非特异结合低为原则［3］选择标记抗体的最佳工作浓度。 1.2.2探索MEIF检测人胰岛素的最佳条件通过对AP催化4-MUP反应条件的探索、优化;对各种检测条件如标准品、磁分离试剂、荧光底物和标记抗体用量,温育时间等条件进行全面探索后确定检测的最佳条件。 1.2.3MEIF检测人胰岛素方法的性能评价通过实验对本检测方法的灵敏度、线形范围、回收率、测定血清稳定性等进行了评价,并与倍爱康生物技术公司人胰岛素试剂盒比较,明确该方法与现有商品化检测试剂盒的相关性。 2结果 2.1荧光的动力学性质在AP和4-MUP荧光体系
8、中,将不同浓度的AP加入荧光底物中,荧光强度(FLI)随AP的浓度和反应时间而变化。FLI随反应的时间延长而增强。AP浓度在1mg/L时,反应较快,180S左右,FLI接近峰值,随后开始缓慢下降;但浓度低10个数量级以下时,反应10min,FLI还
