免疫性卵巢早衰卵巢细胞凋亡发病机理探讨

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1、免疫性卵巢早衰卵巢细胞凋亡发病机理探讨李红梅1苗竹林1韦相才1钟志勇2(1广东省计划生育科学技术研究所510600；2广东省医学实验动物中心528248)【摘要】目的：用左归丸治疗免疫性卵巢早衰小鼠，观察治疗组与模型组等之间卵巢细胞凋亡的形态变化及卵巢颗粒细胞、卵母细胞的凋亡率比较，进一步探讨免疫性卵巢早袞卵巢细胞凋亡的发病机理。方注：建立小鼠免疫性卵巢早袞模型:以小鼠透明带3所合成透明带多肽为免疫原，以其免疫SPF级BALB/C雌性小鼠。以出现动情周期紊乱、卵巢细胞受损，表示造模成功。造模成功后，将BALB

2、/c小鼠随机分为模型组、左归丸高、中、低剂量组和空白对照组，共灌胃给药4周。用Tunnel法检测卵巢颗粒细胞和卵母细胞的凋亡率。结果：模型组小鼠卵巢中颗粒细胞、卵母细胞的凋亡率与对照组比较，只有非常显著性差异(P<0.01)。左归丸低剂量组和高剂量组小鼠卵巢中颗粒细的凋亡率与模型组比较，具有显著性差异(P<0.01)o左归丸低剂量组、中剂量组和高剂量组小鼠的卵母细胞的凋亡率与模型组比较，只有显著性差异(P<0.05)。【关键词】颗粒细胞卵母细胞凋亡率【中图分类号】R363.2【文献标识码】A

3、【文章编号】2095-1752(2013)05-0017-02卵巢的颗粒细胞对维持女性的生殖功能起着重要的作用，其分泌的雌激素对生殖器官发挥广泛的生物作用。卵巢中颗粒细胞的增值和分化是卵泡不断发育至成熟的基木条件，而它的凋亡是卵泡闭锁的前提，卵泡过度闭锁产生卵巢早衰(prematureovarianfailure,POF)[1],在卵巢中，细胞调亡调控着卵泡的繁殖和分化。胚胎形成时，大量的卵母细胞乂是由细胞凋亡调控的，而且，细胞凋亡也参与了卵巢周期中的闭锁过程。可以说是卵巢细胞凋亡直接加快了卵泡闭锁。小鼠用其

4、透明带(ZP)3免疫可致自身免疫性卵巢疾病(AOD),卵巢功能受损将导致将导致颗粒细胞凋亡加速［2】，分泌雌激素的能力下降，发生卵巢功能早衰，严重影响妇女的健康和家庭的稳定。前期实验研究表明：左归丸能有效减缓免疫性POF小鼠，外周血FSH水平升高，提高体内E2水平，抑制AOD产生，改善免疫性POF小鼠卵巢免疫性的炎症损伤［3】，性周期表现为动情间期延长，艽中以左归丸低、高剂量组明显延长［3-4］。朱玲［5］的研究表明左归丸对自身免疫反应所致的卵巢炎和卵巢功能衰退有改善作用，能使卵巢指数、胸腺指数显著增加，卵巢

5、有生机卵泡增多，淋巴细胞和浆细胞浸润减少、NK细胞数量减少。左归丸寓补肾阳于滋肾阴之中，具冇补肾精、养精血、化瘀血之功，临床上用此治疗更年期综合征，可消除烘热汗出、烦燥易怒、口干咽燥等症状，能增加阴道分泌物，改善外阴、阴道干涩症状，对雌激素水平不足的闭经也奋较好的疗效，并可使卵巢早衰患者成功妊娠［6】。本实验目的用左归丸治疗免疫性卵巢早衰小鼠，观察治疗组与模型组等之间卵巢细胞凋亡的形态变化。采用缺U末端标记法(TUNNEL)检测凋亡细胞，TUNNEL法是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞

6、核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比•一般组织化学和生物化学测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。1材料与方法1.1材料1.1.1实验对象BALB/c小鼠，雌性，15〜18g，90只，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号：2008A023。1.1.2实验环境SPF级BALB/c小鼠饲养在广东省医学实验动物中心SPF级实验动物室，环境设施合格证号：粤监证字2007C099,SPF级饲料产自广东省医学实验动物中心。1.1.3受试

7、药物小鼠透明带多肽(其分析纯度>95%):由杭州中肽生物有限公司提供，批号：CC-11-030。弗氏完全佐剂：Sigma公司产品，批号:038K8726；弗氏不完全佐剂：Sigma公司产品，批号：086K8905。左归丸：河南省宛西制药股份有限公司，批号：071203。临床剂量为：一次9克/60kg(约90粒)，2次/日。小鼠按人体重比例计低剂量为临床剂量的5倍、中剂量为临床剂量的10倍，高剂量为临床剂量的20倍。1.1.4药物的配制方法小鼠透明带多肽溶液的配制：称取lmg的透明带3粉末，加入三蒸水配成

8、0.2mg/ml的溶液。免疫试剂：将小鼠透明带多肽溶液：弗氏完全佐剂按照1:1的比例混合，搅拌30min,充分混匀。免疫强化试剂：将小鼠透明带多肽溶液：弗氏不完全佐剂按照1:1的比例混合，搅拌30min,充分混匀。Tunnel细胞凋亡试剂盒：Roche公司产品，批号为1449220。仪器：显微镜：日本奥林巴斯病理图像分析系统，型号BX41.1.2方法小鼠免疫性卵巢早衰模型建立：BALB/c小鼠60只