实验六sds-page

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1、实验三SDS-PAGE【目的要求】1.了解并掌握SDS-PAGE电泳原理及方法。2.掌握垂直板电泳的操作方法。【实验原理】十二烷基硫酸钠(SDS)—聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)可根据蛋白质分子大小的差别分离蛋a质，并可测定蛋白质的相对分子量，其原理主要与电泳过程中存在的特殊物理效应有关。1凝胶的分子筛效应：聚丙烯酰胺凝胶是在催化剂的作用下聚合而成的具有网状立体结构的微孔凝胶，蛋0质颗粒在电场中通过此凝胶吋会受到阻碍。大分子蛋G质受到的阻力大，电泳速度小，而小分子蛋白质受到的阻力小，移动快，因而最终在凝胶中得以分离。2电荷效应：SDS是一种表面活性剂，在蛋白样

2、品和凝胶中加入SDS,则能与蛋白质分子上的疏水基团结合，使蛋白质表面覆盖一层SDS分子。由于十二烷基硫酸根带有大量负电荷，且电荷量远远超过蛋白质分子原有的带电量，因而掩盖了蛋白质分子本身的电荷差别，使各种SDS-蛋白质复合物都带有均等密度的负电荷，分子之间的电荷差异消失。3变性效应：SDS同时还破坏了蛋a质中的非共价键。导致蛋白质变性，使sds-蛋a质复合物在溶液中呈现相似的形状。因此蛋o质在SDS-PAGE凝胶中的电泳迁移率不再受蛋G质原有电荷和形状的影响，而主要取决于分子量的大小。在进行SDS-PAGE电泳吋，同吋使用蛋白质分子量标准样品，则可以在电泳完毕

3、后根据标准分子量大小得知样品蛋白质的相对分子量。4凝胶对样品的浓缩效应：SDS-PAGE使用一种不连续的缓冲系统,即分为低浓度的浓缩胶和较高浓度的分离胶，配制这两种凝胶所用缓冲液的pn值和离子强度也不相同。电泳吋，样品中的SDS-蛋白质复合物首先经过浓缩胶，体积得到极大的浓缩，然后再经过分离胶被分离。5.分子量测定原理：在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下

4、，每克多肽可与1.4g去污剂结合。当分子量在15KD到200KD之问时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合卜‘式：lgMW=K-bX,式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将己知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。【试剂器材】1.30%凝胶贮备液称取30g丙烯酰胺和N，N'-亚甲双丙烯酰胺0.8g,用去离子水配制成100ml的溶液，过滤贮存于棕色瓶中，4°C冰箱保存。2.10%凝胶贮备液称取10g丙烯酰胺和N，N'-亚甲双丙烯酰胺0.

5、5g,用去离子水配制成100ml的溶液，过滤贮存于棕色瓶中4°C冰箱保存。2.10%SDS用去离子水配制，贮存于室温中。3.1%TEMED（N，N，N'，N’-四甲基乙二胺）。5.10%过硫酸铵用去离子水在临用前配制。6.Tris-甘氨酸电泳缓冲液（pH8.3）:Tris6.0g甘氨酸28.8g10%SDS溶液10ml用蒸馏水定容至1000ml7.1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris181.7g，加适量蒸馏水溶解，用浓HC1调节pH值至8.8，加蒸馏水至1000ml（500ml）。8.1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液称

6、取Trisl21.1g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HC1调节pH值至6.8，加蒸馏水至1000ml。（500ml）9.0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液称取Tris6.1g，加500ml蒸馏水溶解，用浓HC1调节pH值至8.0,加蒸馏水至1000ml。（只需要100ml).2x样品缓冲液：蔗糖4g溴酚蓝2mg10%SDS2ml5%p-巯基乙醇0.5ml0.05mol/LTris-HCl,pH8.0，2ml用蒸馏水定容至10.0ml11.0.25%考马斯亮蓝R250将2.5g考马斯亮蓝R250溶解于450ml甲醇中，再加入450ml蒸馏水和10

7、0ml冰乙酸，混匀过滤除去颗粒物质。12.洗脱液将50ml甲醇和75ml冰乙酸溶解于875ml蒸馏水中混匀。13.预染蛋白质分子量标准:117kD、90kD、49kD、35kD、26kD、19kD共6种蛋白质14.电泳槽、电泳仪、扫描仪、染色缸、摇床、一次性手套、微量加样器等。【操作步骤】1制备凝胶⑴准备玻璃板，洗净、晾干。按电泳槽使用说明装好，按下表配制12%分离胶溶液。浓缩胶和分离胶的配置5%浓缩胶的配置各组分名称各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量1ml2ml3ml4ml5ml6ml8ml蒸馏水0.681.42.12.73.44.15.530%丙烯酰胺0

8、.170.330.50.670.831