唑来膦酸对骨肉瘤细胞生物学行为的影响

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1、唑来膦酸对骨肉瘤细胞生物学行为的影响【】目的研究唑来膦酸对骨肉瘤lm8细胞株黏附、迁移、侵袭和基质金属蛋白酶(mmp2、mmp9)的影响。方法不同浓度的唑来膦酸处理lm8细胞，用cck8法检测细胞毒作用和lm8细胞的黏附力；细胞划痕试验检测lm8细胞的迁移力；trans8细胞对细胞外基质(ecm)的侵袭力；采用酶联免疫吸附实验(elisa)检测培养上清液中基质金属蛋白酶(mmp2、mmp9)的含量。结果经过6.25μmol/l、12.5μmol/l、25μmol/l的唑来膦酸处理后，lm8细胞

2、的黏附、迁移和侵袭力均明显下调，培养上清液中的基质金属蛋白酶(mmp2、mmp9)的含量也明显下降。结论唑来膦酸可抑制骨肉瘤lm8细胞的体外黏附、迁移和侵袭力，并同时明显降低lm8细胞分泌基质金属蛋白酶。【关键词】唑来膦酸骨肉瘤黏附迁移侵袭mmp2mmp9双膦酸盐是一种强有力的骨吸收抑制剂，被广泛的应用于治疗骨质疏松症，变形性骨炎和恶性肿瘤引起的高钙血症和骨痛症等[1]。除了强大的抗骨吸收功能外,双膦酸盐抗肿瘤作用受到越来越多的重视。骨肉瘤是一种转移性的肿瘤，本研究探讨第三代双膦酸盐——唑来膦酸

3、对骨肉瘤lm8细胞黏附、迁移、侵袭和基质金属蛋白酶(mmp2、mmp9)的影响，以评价唑来膦酸抑制骨肉瘤转移的效果。1材料和方法1.1主要试剂和仪器唑来膦酸(择泰，瑞士诺华制药产品，北京诺华公司惠赠)；骨肉瘤细胞株lm8购于第四军医大学实验动物中心；rpmi1640培养液为hyclone公司产品;小牛血清为兰州民海生物公司产品；纤连蛋白（fn）购自sigma公司；基质胶matrigel购自collaborativersearch公司；transmp2和mmp9elisa试剂盒为oncogene公

4、司产品。.133229.美国shellab2300型恒温co2细胞培养箱，日本olympusbh2型光学显微镜，美国biotect2550型自动酶标光度仪等。1.2细胞培养骨肉瘤细胞株lm8贴壁生长于含10％新生牛血清(ncs)rpmi1640培养液中，于37℃、5％co2的饱和湿度孵箱中培养。生长至70％～80％融合时将细胞用0.25％的胰酶消化后传代，取对数生长期细胞作后续实验。1.3细胞黏附试验将10μg/ml的fn以50μl/孔加入96孔板，4℃包被基膜过夜，次日水化基底膜，即吸出残余液体，每

5、孔加入100μl含10g/lbsa的pbs,37℃孵育1h。分别取6.25、12.5、25.50、100μmol/l不同浓度唑来膦酸处理24h的lm8细胞，经洗涤、消化后用prmi1640液稀释，调细胞浓度为5×105/ml，分别加入到处理后的96孔板，每孔100μl，每组平行设3个复孔，37℃、5％co2条件下温育1h，温育结束后弃去各孔培养液，pbs冲洗除去未黏附细胞，弃pbs后加100μl培养液和10μl的cck8试剂，37℃、5％co2条件下孵育4h后用酶标仪测各孔450nmod值。黏附抑制率

6、(%)＝1-(实验组od值／对照组od值)×100％1.4细胞迁移试验将处于对数生长期的lm8细胞接种于6孔培养板中,置37℃、5%co2及饱和湿度的培养箱中培养。待细胞覆盖孔底80%以上时,在单层细胞表面用200μl枪头在孔中划一直线后,用pbs漂洗2次以去除划下的悬浮细胞，加入不同浓度的唑来膦酸的培养基继续培养24h;倒置显微镜下观察划痕中细胞迁移情况。1.5细胞侵袭实验在transg／ml的matrigel50μl，37℃、30min使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。取指数生长期lm8细胞，以0.

7、25％胰酶消化、离心、计数后，以0.1％bsa的rpmi1640培养液调整细胞数1×106／ml，取细胞100μl接种于transi1640培养液600μl，置37℃、5％co2培养箱中48h。培养结束，将滤膜以甲醇固定，棉签擦掉膜表面细胞，然后用giemsa染料染色10min。200倍光镜下选择膜上下左右中5个不同视野的穿过膜的细胞数,按下式计算药物对肿瘤细胞的侵袭抑制率。抑制率(%)＝1-(实验组平均侵袭细胞数/对照组平均侵袭细胞数)×100％1.6cck8法检测细胞毒性取对数生长期lm8细胞，以

8、rpmi1640培养基调整细胞浓度至5×104／ml加入96孔培养板中，每孔加细胞悬液100μl,24h后吸弃培养基，加入含不同浓度唑来膦酸的rpmi1640培养基，置于37℃、5％co2的饱和湿度孵箱中培养，48h后取出培养板，每孔加入10μlcck8，继续培养4h后,用酶标仪在450nm处测定每孔光吸收值（a值），并计算细胞生长抑制率。细胞生长抑制率(%)=（1-实验组a值/对照组a值）×100%1.7酶联免疫吸附实验(elisa)检