细胞凋亡和其检测方法

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1、神经细胞培养第一节：细胞培养的基本知识1定义：组织培养(Tissueculture)：细胞培养(cellculture)：器官培养(organculture)：统称为体外培养（Invitro)2组织或细胞培养的优点：1）：研究对象是活细胞2）：研究条件可以人为的控制3）：研究的样本可以达到比较均一性4）：研究的内容便于观察、检测和记录5）：研究的范围比较广泛6）：研究的费用相对比较经济7）：可作为一些遗传物质的运载细胞8)：干细胞的广泛应用前景3组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差异；2）细胞培养存在一定的不稳定性4培养细

2、胞的特性1）培养细胞生长方式：a贴附生长型细胞（大多数）b悬浮生长型细胞（少数）2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性5培养细胞生长的条件1）细胞的营养需要：a基本营养物质：氨基酸、维生素、碳水化合物及一些无机离子；b营养因子等物质2）细胞的生存环境：a温度：哺乳动物和人类为35~37℃；鸟类为38.5℃b气相及PH值：O2及CO2的值：CO2=5%；PH=7.2~7.4c渗透压：260~320mmol/L3)无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！！无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、底物、培养基，蒸

3、馏水等；间接接触者—配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等无污染：微生物及交叉污染6常用的培养用液及培养基•培养用液：水平衡盐溶液（ＢＳＳ）（见表）消化液１胰蛋白酶液（０．２５）２二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）３胶原酶•培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白）合成培养基（ＭＥＭＤＭＥＭＨＡＭ`SF12ＲＰＭＩ（１６４０）１９９Ｌ－１５等）常用的平衡盐溶液（g/L）RingerPBSEargleHanksDulbeccoD-Ha(1985)(1948)(1949(1954)NaCl9．008．006．808．008．008．

4、0KCl0．420．200．400．400．200．4CaCl20．250．200．141．10MgCl.6H2O0．10MgSO4.7H2O0．200．20Na2HPO4.H2O1．560．060．0Na2HPO4.2H2O1．142．42KH2PO40．200．060．200．0NaHCO33．200．350．3葡萄糖1．001．00酚红0．020．020．020．0第二节：神经细胞体外培养的基本概念和方案•神经细胞培养的类型1神经细胞的原代培养原代培养（primaryculture)：指从活体获得细胞、组织或器官在体外条件

5、下进行的第一次培养传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。2神经细胞系培养细胞系的生长过程：有限细胞系：原代培养传代期衰退期无限细胞系：滞留期指数增长期平台期原代细胞系阶段指培养数２０无限细胞系细１８胞１６数１４量１２有限细胞系１０８６０２４６８１０１２２４３４４４培养时间（周）二、常用试剂1）培养液ADMEM：BF12培养液CDMEM/F12培养液D无血清培养液加神经营养因子2）D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）

6、（HBSS）3)聚L-赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10min4)神经营养因子：睫状神经营养因子（ciliaryneurotrophicfactor,CNTF):支持交感神经、副交感神经和感觉神经的生长与存活；脑源性神经营养因子（brainderivedneurotrophicfactor,BDNF):支持外周和中枢特殊细胞群体的神经细胞；硷性成纤维生长因子（basicfibroblastgrowthfactor,bFGF)等三、培养操作过程•新生1～3dSD大鼠，75%酒精浸泡约消毒，断头后移入超净工作台，无菌条

7、件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织（海马），放入10ml小瓶中•剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振摇促消化。消化约20min，•用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次10min，•吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数，•用含10%胎牛血清的DMEM培养基，稀释细胞制成1×106/ml细胞悬液，接种于经多聚赖氨酸处理过的24孔培养板或培养瓶内（板孔放置

8、0.8х0.8cm的小盖玻片），放入5%CO2培养箱，37℃培养。四、神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶（NeuronspecificenoloseNSE）、微管相关蛋白（MicrotubuleassociatedproteinMAP2）——神经元,五、神经元的