山仔水库主要水华蓝藻种类的分离与鉴定

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1、山仔水库主要水华蓝藻种类的分离与鉴定　：以福州山仔水库蓝藻发生期的水样为材料，分离获得了2株形态不同的蓝藻。在形态学鉴定的基础上，进一步以16SrRNA基因为分子标记，对分离获得的2株水花蓝藻进行了分子鉴定。结果显示：山仔水库夏秋发生的水华优势种为铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa），春末发生的水华优势种为浮游鱼腥藻（Anabaenaplanctonica）。研究首次对山仔水库不同季节的水花蓝藻种类进行了生物鉴定，其结果可为蓝藻水华的监测与防治提供基础性资料。　　关键词：山仔水库；蓝藻水花；分子鉴定　　：X52　　：A：16749944（2017）22001304　　

2、1引言　　水华是淡水水体富营养化进程中形成的有害现象，是湖库生态系统退化的典型表征。蓝藻是最简单、最原始的的原核生物之一，是形成水花的最常见物种。已知蓝藻约有2000多种，由于蓝藻具有极强的适应性，分布极广，因此也具有较高的遗传多样性。　　山仔水库是福州市及其周边地区的第二饮用水源地。山仔水库自2000年首次发现蓝藻水华以来，蓝藻水华现象常年频发[1，2]。本课题在生态调研中，发现库区的水华优势种有明显的季节更替现象。根据形态特征初步判断水华优势种为微囊藻属（Microcystis）和鱼腥藻属（Anabaena）的种类[3，4]。传统的藻类种类鉴定方法主要是依据形态学特征进行鉴定。由于蓝

3、藻不同物种间的差别十分细微，且环境因素对藻体的形态也有很大的影响，因此，在光学显微镜下，蓝藻种类的鉴定存在一定的困难与偏差。此外，鱼腥藻属的定种一般需要孢子的形态特征，而本次调研没有发现孢子，故形态上无法定种。因此有必要进一步进行分子鉴定。　　分子生物学方法由于操作容易、结果可靠，已被广泛应用在环境微生物群体的测定和鉴别上。目前用于蓝藻分子鉴定和系统发生研究的方法主要有核糖体的16SrRNA和ITS等基因，并取得一定效果[5，6]。本专题在山仔水库蓝藻水华爆发期间，分离纯化获得两株水华蓝藻。在形态分类的基础上，进一步提取水华蓝藻的基因组DNA，克隆其16SrRNA基因并进行测序，将测序结

4、果提交GenBank，构建系统进化树，以确定两种水华蓝藻的遗传属性。　　2材料与方法　　2.1藻株分离纯化　　于2015年4月至2016年5月的水华发生期间，在山仔水库蓝藻水华聚集处用浮游生物X多次采集带有蓝藻水华的水样。获取的水样立即送往实验室进行细胞分离。丝状体种类采用毛细管分离法；单细胞和群体类型的种类则采用平板分离法。　　分离后的藻细胞经多次平板分离纯化，最后挑取纯化后的单藻落用锥形瓶进行扩培。培养用BG11培养基，于恒温光照培养箱保种培养，光强为1500～2000lx，光暗周期12：12h，温度控制为25±1℃。　　2.2形态分类鉴定　　分别取水华发生期的水样和分

5、离纯化藻株的培养物制成临时水装片，直接于OlympusBX51型光学显微镜下观察、拍照，并根据有关文献[7，8]进行形态分类鉴定。　　2.3分子生物学鉴定　　将分离纯化后的藻株富集培养，取生长期藻细胞用DNA试剂盒提取蓝藻基因组DNA。用于扩增蓝藻16SrRNA的引物为原核生物通用引物（由铂尚生物公司合成）。PCR扩增产物由1%的琼脂糖凝胶电泳检测，产物由上海生工进行测序。测序结果通过NCBI的BLAST进行比对，并将测序结果和从Genebank上下载的序列通过分子进化遗传分析软件Mega5.05进行对位排列，并采用邻接法（NJ）构建分子系统树。　　3结果与分析　　3.1两株水华蓝藻形态

6、特征　　在山仔水库蓝藻水华发生期间，直接采集水华样品进行光学显微观察，镜检结果发现，春季发生的优势种类为一种丝状体型的蓝藻；夏秋发生的优势种类为不定型胶群体蓝藻。两种水华蓝藻种类的形态特征如下。　　（1）群体体型的优势种类（见图1）。其藻体呈橄榄绿色，为不规则团块状，或形成穿孔的X状团块胶群体。群体胶被无色透明，边缘部份水化。细胞球形、近球形，直径约3～5μm。群体中细胞分布均匀，有时密贴。细胞原生质体灰绿色、蓝绿色，具伪空泡（气囊）。根据相关文献对微囊藻属种的描述，其形态特征与铜绿微囊藻种类接近。故初步鉴定为铜绿微囊藻（Microcystisaeruginosa）。　　（2）丝状

7、体型的蓝藻（见图2）。藻体单生，无明显胶被。藻丝直或稍微弯曲，末端不变细。营养细胞球形或扁球形，宽为7.7～11.4μm，长约4.9～11.4μm，细胞具气囊。异形胞为球形或扁球状，直径约8.3～10.7μm，未发现有孢子。从藻体形态来看，该丝状蓝藻与文献[9]中鱼腥藻属的形态特征描述相符。由于未发现孢子，而孢子的形态、位置是鱼腥藻属的定种依据之一，故只能初步鉴定山仔水库的丝状蓝藻为鱼腥藻（Anabaenasp.）