化学键合相色谱法

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1、一、原理   “化学键合相色谱法”——采用化学键合相作固定相的液相色谱法。　　化学键合相是利用化学反应通过共价键将有机分子键合在载体（硅胶）表面，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的固定相。其分离机理为吸附和分配两种机理兼有。对多数键合相来说，以分配机理为主。通常，化学键合相的载体是硅胶，硅胶表面有硅醇基，≡Si–OH，它能与合适的有机化合物反应，获得各种不同性能的化学键合相。　　从键合反应的性质可分为：酯化键合（≡Si-O-C）、硅氮键合（≡Si-N）和硅烷化键合（≡Si-O-Si-C）等；硅烷化键合相应用最广泛。这种键合相

2、是用有机氯硅烷与硅醇基发生反应：≡Si–OH+C18H37SiCl3→≡Si-O–Si–C18H37+HCl,这种固定相在pH=2～8.5范围内对水稳定，有机分子与载体间的结合牢固，固定相不易流失稳定性好。　　十八烷基硅烷键合相（Octadecylsilane简称ODS或C18）：是最常用的非极性键合相。它们用于反相色谱法，在70℃以下和pH2～8范围内可正常工作。　　化学键合固定相具有如下优点：　　①柱效高：传质速度比一般液体固定相快；　　②稳定性：耐溶剂冲洗，耐高温，无固定液流失，从而提高了色谱柱的稳定性和使用寿命；　 

3、应用范围广：改变键合有机分子的结构和基团的类型，能灵活地改变分离的选择性，适用于分离几乎所有类型的化合物；且能用各种溶剂作流动相（梯度洗脱）。二、流动相　　化学键合相色谱所用流动相的极性必须与固定相显著不同，根据流动相和固定相的相对极性不同分为：　　1、正相键合相色谱法：流动相极性小于固定相极性。　　常用非极性溶剂如烷烃类溶剂，样品组分的保留值可用加入适当的有机溶剂（调节剂）的办法调节洗脱强度。常用有机溶剂为极性溶剂如氯仿、二氯甲烷、已腈、醇类等。　　适用于分离中等极性化合物，如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂、有机氯

4、农药等。　　2、反相键合相色谱法：流动相极性大于固定相极性。　　流动相多以水或无机盐缓冲液为主体，再加入一种能与水相混溶的有机溶剂（如甲醇、乙睛、四氢呋喃等）为调节，根据分离需要，改变洗脱剂的组成及含量，以调节极性和洗脱能力。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。固定相一般为C18、C8。　　反相键合相色谱法应用最广泛，因为它以水为底溶剂，在水中可以加入各种添加剂，改变流动相的离子强度、pH值和极性等，以提高选择性，而且水的紫外截至波长低，有利痕量组分的检测，反向键合相稳定性好，不易被强极性组分污染，且

5、水廉价易得，安全。荧光素荧光与PH关系假设荧光物质为弱酸或者是弱碱性物质，溶液的PH会对荧光物质的强度产生很大的影响。大多数含酸性或者是碱性的芳香族化合物的荧光光谱对于溶剂的PH和氢键能力很敏感。体系的PH的变化影响了荧光基团的电荷状态。当PH改变时，配位比也会发生改变。从而影响金属离子-有机配位体荧光配合物的荧光发射。高浓度样品对荧光的影响，高浓度样品应该进行稀释激发光照射高浓度样品，在激发光入口附近产生荧光，但这些荧光不会进入荧光检测器。高浓度样品中，分子之间相互作用发生活性阻碍作用荧光的再吸收荧光和磷光的区别磷光是一种

6、缓慢发光的光致冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线或X射线）照射，吸收光能后进入激发态（通常具有和基态不同的自旋多重度），然后缓慢地退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段），而且与萤光过程不同，当入射光停止后，发光现象持续存在。发出磷光的退激发过程是被量子力学的跃迁选择规则禁戒的，因此这个过程很缓慢。荧光（Fluorescence）：由多重度相同的状态间发生辐射跃迁产生的光，如S1→S0的跃迁。分子由激发态回到基态时，由于电子跃迁而由被激发分子发射的光。物质经过紫外线照射后发出荧光

7、的现象可分为两种情况，第一种是自发荧光，如叶绿素、血红素等经紫外线照射后，能发出红色的荧光，称为自发荧光;第二种是诱发荧光，即物体经荧光染料染色后再通过紫外线照射发出荧光，称为诱发荧光。磷光和荧光的区别：磷光是不同多重度的状态间辐射跃迁的结果，由于该过程是自旋禁阻的，因此与荧光相比其速度常数要小的多。拉曼光和分子荧光磷光荧光和磷光都是物质从激发态跃迁，自发辐射产生的。通常自发辐射强度都有一个衰减过程，衰减过程最初的一段时间内的辐射，称之为荧光，之后的衰减过程称之为磷光；瑞利光是光子遇到微小粒子散射产生的，瑞利光的频率和入射光

8、是同样的；拉曼光是入射光子和分子相互作用后产生，会生成两种频率成分，一种是入射光频率减去分子振动能级频率，一种是入射光频率加上分子振动能级频率，在频谱上，前一种称之为斯托克斯线，强度较大，后一种称之为反斯托克斯线，强度非常弱。分子离子峰在质谱分析中有机化合物样品的蒸气进入电离室,受到电子流