北京林业大学学报投稿格式 3

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1、杨树MYB基因家族成员PtMYB1470的克隆王军（生技11-1,110414119）摘要：PCR扩增；PCR产物与T-vector连接；连接产物转化感受态细胞；PCR筛选阳性克隆关键词：PCR，克隆，筛选，感受态细胞1目的基因克隆1.1目的基因1.1.1杨树的基因PtMYB1470(1900bp)2PCR反应2.1反应体系2.1.1ComponentsVolume(20mL)ddH2O13.2mL10×PCRBuffer2mL2.5mMdNTPs1.6mL上游引物(10pmol/mL)0.4mL下游引物(1

2、0pmol/mL)0.4mLDNA模板2(about100ng)Taq(4,5units/mL)0.2mLTotal20mL2.1.2引物序列ForwardPrimer:5-GAGCTCATGGTAAGCTCATTAGGAG-3ReversePrimer:5-GGTACCTCATTGTTGATCTATTTCTGT-32.2PCR反应条件2.2.194℃5min，(94℃30s，58℃30s，72℃1min)×30个循环，@72℃for7min.2.3结果2.3.1琼脂糖凝胶电泳52.4结果分析2.4.1从图中

3、可见第五道为2000marker，第78有条带，说明PCR成功。3PCR产物与T－载体连接3.1反应体系3.1.1ComponentsVolume(mL)ddH2O2mL/（0mL）10×ligationbuffer1mLPCRproduct6mL/（8mL）pGEM-Teasyvector0.5mLT4-DNAligase0.5mLTotal10mL512-16℃连接过夜。4连接产物转化感受态细胞4.1反应步骤4.1.1将连接产物与感受态细胞混合，冰上放置30min；4.1.2于42℃热激90s后迅速放冰上

4、2min;4.1.3加入1mLLB(不含氨苄青霉素)，混合后于37℃保温1hr;4.1.44000rpm离心4min，吸取上层液体LB直至管内体积约为150mL左右，用吸头轻轻悬浮混匀，在含100g/mL氨苄青霉素的LB固体培养基平板(直径7cm)表面涂30mLx-gal(20mg/mL,用二甲基甲酰胺配制)和3mLIPTG(200mg/mL),然后涂布转化后的细菌.37℃培养12-16h。5检测5.1PCR5.1.1挑取分离良好大小均匀的菌斑分别置于盛有20mL液体LB洁净的离心管中，混匀后，取1-2mL做

5、PCR反应模板。5.1.2反应体系ComponentsVolume(20mL)ddH2O14mL10×PCRBuffer2mL2.5mMdNTPs1.6mL上游引物(10pmol/mL)0.6mL下游引物(10pmol/mL)0.6mLDNA模板1(about100ng)5Taq(4,5units/mL)0.2mLTotal20mL5.1.3反应时间和退火温度94℃5min，(94℃30s，58℃30s，72℃1min)×30个循环，@72℃for7min.5.2PCR结果5.2.15.2.2图中可见两条清晰

6、条带为15000，2000marker，凝胶底部没有见到阳性条带。。。。。。。致谢谢谢安老师的精心指导！55