沉默net-1基因

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1、沉默NET-1基因对肝癌细胞生物学行为的影响陈莉，王桂兰，秦婧，吴园园，朱建伟南通大学附属肿瘤医院病理科南通大学医学院病理学教研室肝细胞肝癌（hepatocellularcarcinomaHCC）是全球性的健康问题之一。我们南通启东是WHO确定的HCC高发研究现场。研究基于我们的首次发现NET-1在HCC组织中特定表达，并发现该基因参与HCC细胞的分裂增殖和癌发生、发展密切相关的细胞运动过程,探讨针对NET-1的siRNA抑制肝癌癌细胞株(SMMC-7721)中NET-1基因的表达，及该基因对癌细胞增殖、迁移、内吞的影响。一、项目研究背景NET-1与NE

2、T-2到NET-7一起统称为NET-X，它们是由Serru等于2000年在EST数据库中发现的7个新的含4次跨膜蛋白超家族(transmembrane4superfamily或tetraspanfamily,简称TM4SF)的成员。NET-1(C4.8、P503s、Tspan-1)定位于染色体1p34.1上，其mRNA全长为1297bp(基因库登记号码AF065388)，为TM4SF的成员之一，最近证实其为肿瘤相关基因。1、NET-1siRNA表达质粒和myc-NET-1重组表达质粒的构建。2、细胞培养与转染。3、细胞内总RNA抽提及RT-QPCR检测N

3、ET-1mRNA。4、Westernblot检测NET-1蛋白表达。5、CCK-8法检测细胞增殖活性。6、流式细胞仪(FCN)检测各组细胞处于不同细胞周期中的比例与增殖指数。7、细胞划痕试验检测细胞二围空间的迁移能力。8、Transwell小室检测细胞三围空间的迁移能力。9、Capture-ELISA方法测量细胞内生物素标记的转铁蛋白水平。10、anti-uPAR标记的癌细胞伪足形成实验。一、材料与方法系统组织成人组织胎儿组织恶性组织第一组第二组第三组消化系统胃+NA*+食道+NANA小肠+NANA结肠+NANA直肠+NA+胰腺－NA+肝－－+泌尿生殖系

4、统肾+++睾丸+++宫颈+NA(halan细胞l)+宫体+NA+前列腺+NANA乳腺+NANA内分泌系统垂体+NANA甲状腺+NANA肾上腺+NANA淋巴造血系统造血细胞－NA－**淋巴结+NANA骨髓－NANA脾脏+NANA胸腺+NANA神经系统脑++NA脊髓+NANA视网膜+NANA其他心－+黑色素瘤+肺++NA肌肉++NA皮肤++NA胎盘+NANA*NA:现在未做检测；**白血病，淋巴瘤1.检测人体组织中NET-1mRNA表达锁定研究目标——HCC二、结果M1234567891011LanesM:200ngof1kbsizeladder(NewEn

5、glandBioLabs);Lanes1-3:NormalFetalLiverTissues;Lanes4-7:NormalAdultLiverTissues;Lanes8-11:LiverCancerTissues转染NET-1siRNA和myc-NET-1后SMMC-7721细胞中NET-1mRNA的表达（RT-QPCR）以未处理组为1。NET-1-siRNA组和myc-NET-1组分别与未处理组相比(●P<0.05，●●p<0.01)；NET-1-siRNA组与pU6H1-GFP组相比(▲P<0.05，▲p<0.01)；myc-NET-1组与pcD

6、NA3.1/myc组相比(★P<0.05，★★p<0.01)2、RT-QPCR检测转染NET-1siRNA和myc-NET-1细胞中NET-1mRNA的结果3.NET-1蛋白表达在HCC组织中显著高于癌旁组织中。ß-actinNET-1Lanes1,3,5,7canceroustissues;Lanes2,4,6,8:adjacentnoncanceroustissues（1）随时间的延长NET-1-siRNA处理组细胞增殖明显减少；NET-1稳定表达组细胞增殖明显增多。4.干扰NET-1可以抑制HCC细胞增殖（2）NET-1-siRNA处理组细胞存在G

7、0/G1和G2/M期阻滞，G0/G1和G2/M期细胞比例分别增加了17.04%和10.97%，S期细胞比例降低。NET-1稳定表达组细胞更快地进入细胞周期进程，G0/G1期细胞比例明显降低。GFPsiRNA组NET-1siRNA组对照组NET-1过表达组5.干扰NET-1可以抑制HCC细胞迁移在NET-1siRNA组中显著减少(p<0.05)，在myc-NET-1组中明显增加(p<0.05)。Mock组与未处理组间差异未见显著统计学意义（均p>0.05）NET-1siRNA处理细胞后迁移能力明显下降。转染48h后穿过Matrigel胶细胞数NET-1si

8、RNA组（21.42±5.74）和pU6H1-GFP（45.60±8.25）差异