htertmrna在胃癌中表达及其与预后的效果观察

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1、hTERTmRNA在胃癌中表达及其与预后的效果观察胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，就诊患者中约90%为进展期胃癌，极易发生侵袭、转移，预后差，严重威胁着人们的身体健康。探讨胃癌侵袭转移的分子机制，寻找与其相关的生物学标志物是当今肿瘤学研究的热点之一[1]。端粒酶是一种与细胞永生化和肿瘤形成相关的核糖核蛋白酶，它能够以细胞内部的一段RNA为模板合成端粒末端重复序列而延长端粒，从而使细胞永生化。人端粒酶逆转录酶（humantelomerasereversetranscriptase，hTERT）是人类端粒酶的催化亚单位，是端粒酶活性高低的限

2、速酶。hTERT的表达与端粒酶活性呈正相关，可以反映端粒酶活性的高低[2-4]。研究已证实，端粒、hTERT与正常细胞生长调控及恶性肿瘤之间密切相关。目前有关hTERT在胃癌中的研究多集中在胃癌发生的始动阶段，hTERT高表达可促进胃癌的发生[5]。然而，hTERT与胃癌侵袭、转移及预后的关系研究相对较少。本研究选取52例胃癌患者为研究对象，应用RT-PCR方法检测hTERTmRNA在同一患者的正常胃黏膜、胃癌原发灶及转移灶（即转移淋巴结）中的表达，通过随访，系统研究hTERTmRNA在胃癌中的表达情况及其与胃癌恶性生物学行为和预后的关系。1

3、资料与方法1.1一般资料以2001年9月～2002年9月中国医科大学附属第一医院肿瘤外科52例胃癌患者为研究对象，收集患者新鲜大体组织标本。在手术切除胃癌大体标本30min内，切取胃原发癌灶和正常胃黏膜及转移淋巴结，放入消毒灭菌的EP管中，于液氮中速冻0.5h后转入-70℃冰箱中冻存等待检测，以上标本均经病理证实，并保留其石蜡标本。对52例患者进行随访，主要通过门诊复查、信函问询、派出所户籍查询等，随访终点为2010年9月，随访率为100%，随访时间为8～106个月，平均48.5个月。1.2RT-PCR检测hTERTmRNA的表达严格按照TR

4、Izol试剂盒说明书进行操作，提取所有新鲜大体标本总RNA，测定其OD260、OD280值，对总RNA进行定量；应用RNA琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。取高质量总RNA1g进行逆转录合成第一链cDNA，然后取3lcDNA水溶液进行PCR扩增，具体条件：94℃5min，94℃40s、58℃45s、72℃60s（30个循环），72℃7min。hTERT基因引物序列为：5-CGTCCAGACTCCGCTTCAT-3，5-TGCTTCTTGTGGTCCTCAGA-3，产物为340bp；内参基因GAPDH引物序列为：5-AGGGGTCTACATGGCAA

5、CTG-3，5-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3，产物为227bp。扩增产物经梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳银染色检测，详细步骤参见文献[6]。用FluorchemV2.0StandAlone电泳凝胶扫描仪对电泳凝胶进行扫描，应用其自带的分析软件进行灰度（A）测定，电泳中有扩增产物条带者为阳性，无扩增产物条带者为阴性；计算hTERTmRNA表达指数（ImRNA），I=A（hTERT）/A（GAPDH），ImRNA与其在组织中的表达量呈正比。1.3统计学方法应用SPSS19.0统计软件分析数据，应用配对均数t检验比较hTERTmRNA在胃原

6、发癌灶、正常胃黏膜、淋巴结转移癌中表达的差异；应用单因素方差分析评估其在胃原发癌中表达与胃癌生物学行为的相关性；应用KaplanMeier分析绘制生存曲线，采用LogRank检验评估其在胃原发癌灶中表达与预后的关系，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1hTERTmRNA在胃原发癌灶、正常胃黏膜和淋巴结转移癌中表达情况的比较与正常胃黏膜（0.0220.093）相比，hTERTmRNA在胃原发癌灶中（0.5150.352）表达水平（t=9.969，P0.01）和淋巴结转移癌中（0.7290.578）表达水平（t=7.814，P0.01）明

7、显增高，且在淋巴结转移癌中增高更明显，而其在胃原发癌灶和淋巴结转移癌中表达水平差异无统计学意义（t=1.602，P=0.117）。在胃正常黏膜中多数表达阴性或仅有微弱条带。内参基因GAPDH在不同标本中表达水平基本一致（图1）。2.2hTERTmRNA在胃原发癌灶中表达与胃癌生物学行为的相关性经过单因素方差分析发现，胃原发癌灶中hTERTmRNA表达水平在浸润型癌、肿瘤浸透浆膜面、浆膜侵犯面积20cm2、淋巴结分期（7thTNM分期）晚者（N3）者中表达水平明显增高，而在限局型癌、肿瘤未浸透浆膜面、浆膜侵犯面积20cm2、淋巴结分期早者（N1

8、～2）中表达水平相对较低。其表达水平与其他临床病理因素无明显相关性（如肿瘤大小、部位、分化程度、生长方式、有无脉管癌栓，患者性别、年龄等）（表1）。2.3hTERT