第七章抗原抗体反应及应用2011

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1、第七章抗原抗体反应及应用抗体与相应的特异性抗原相结合，称抗原抗体反应。是一类微量，灵敏，快速的检测分析方法。第一节抗体的制备抗血清：用抗原免疫动物，获得的血清含有特异性抗体，称为抗血清。多克隆抗体：由多个B细胞克隆产生的多种抗体的混合物即多克隆抗体。一、抗血清的制备抗血清的分离纯化抗原注射动物采血佐剂多克隆抗体抗原决定簇的多样性1、抗原2、免疫动物（1）动物选择（2）免疫剂量、途径和时间3、采血（1）时间：（2）方式：心脏采血法，颈动脉放血法：（3）血清分离：4、抗血清的纯化：硫酸铵盐析法，层析法5．抗血清的保存：低温保存，反复冻融使抗体很快失活。6、抗血清的特性鉴定免疫效果检测参

2、数：效价，亲和力及交叉反应等。效价(滴度)，抗体含量的半定量指标，即在给定的条件下，结合一定量抗原的抗血清的稀释度。亲和力：表示抗血清与相应抗原的结合强度，是描述抗体特异性的重要指标，常用亲和常数K表示。交叉反应:抗原不纯两个不同抗原具有部分相似决定簇单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb或MAb)由单一种B细胞克隆产生的一种均一的、只作用于单一抗原决定簇的高度特异性抗体。1975年英国科学家Milstein和Kohler建立了单克隆抗体技术。获得1984年诺贝尔医学和生理学奖。二、单克隆抗体的制备HAT培养基筛选B细胞免疫动物融合脾脏骨髓瘤细胞阳性克隆杂交瘤细胞

3、单克隆化单克隆抗体扩大生产骨髓瘤细胞培养F制备流程RHAT培养基选择原理①瘤细胞本身不产生抗体或者产生抗体的某种链，但不能分泌；②是次黄嘌呤鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)的缺陷型。这种缺陷型的瘤细胞正常的核酸合成途径被氨基喋呤(A)阻断后，因核酸合成的旁路无法利用底物次黄嘌呤和胸腺嘧啶而死亡。而杂交瘤细胞因带有B细胞的全套基因，在HAT存在的条件下借助于HGPRT和TK的作用通过替代的核酸合成途径能正常合成DNA和RNA。所以杂交瘤能正常地生长繁殖而被选择出来。未被融合的游离的B细胞只能存活3d而后自行死亡。克隆化将许多细胞克隆混合生长的细胞分离为单个细胞克隆

4、的过程。有限稀释法将混合细胞稀释后分装于培养板中，使培养板的大部分孔中只有一个细胞的方法。R抗原脾B淋巴细胞融合融合淋巴细胞骨髓瘤细胞克隆1克隆2克隆3克隆4重组抗体借助DNA重组技术和蛋白质工程技术，在基因水平上对Ig进行切割、拼接或修饰，重新组装成为新型抗体分子。三、抗体工程如人-鼠嵌合抗体、重构抗体、单链抗体、单域抗体、小分子抗体、双特异性抗体等。1、嵌合抗体（Chimericantibodies）将鼠Ig可变区基因，与人Ig恒定区的基因连接，插入适当质粒，构建鼠-人嵌合的重链和轻链基因质粒载体，共同转染宿主细胞，表达鼠-人嵌合抗体.人-鼠嵌合抗体重构抗体2、小分子抗体Fab片

5、段、Fv片段单链抗体：将抗体轻重链的可变区片段连接起来双特异性FvVHVLVHVLVHaVLaVHbVLb双价Fv3、双特异性抗体采用适当的接头如亮氨酸拉链结构将不同抗体的VH和VL区连起来.四、催化性抗体有催化活性的抗体五、抗体在抗肿瘤治疗中的应用第二节抗原抗体反应原理一、抗原抗体反应的原理抗原抗体反应（antigen-antibodyreaction）是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。因抗体主要存在与血清中，故又称为血清学反应。Ab+AgAb-Ag复合物(可见或不可见)荧光素酶放射性同位素生物素-亲和素二．抗体与多价抗原结合的浓度带现象抗体与单价抗原形成复合物----

6、可溶性抗体与多价抗原形成的复合物----形成沉淀带现象：如抗原或抗体过剩，则抗原与抗体仅能形成小分子的复合物，不出现肉眼可见的反应。前带(pro-zone)现象后带(post-zone)现象三．交叉反应四、抗原、抗体反应的一般规律（1）特异性（2）可逆性Ab+AgAb-Ag复合物（3）定比性:只有当两者比例合适时，才会出现可见反应。（4）阶段性1、初级反应阶段：抗原与抗体发生特异性结合。反应快，仅需几秒至几分钟，但不出现可见反应。2、次级反应阶段：可见反应阶段，抗原抗体复合物进一步交联和聚集，出现可见的沉淀。反应慢，往往需要数分钟至数小时。第二阶段受多种因子影响:如抗原抗体的比例、p

7、H、温度、电解质和补体等（5）条件依赖性最佳条件一般为pH＝6－8，温度为37－45℃，适当振荡，以及用生理盐水作电解质等。第三节常见免疫分析方法抗原抗体反应的种类免疫学技术的发展趋向特异性、敏感性、精密的分辨能力、高水平的定位、试验电脑化，反应微量化，方法标准化、试剂商品化、方法简便快速。用单克隆抗体提高特异性；用各种标记技术提高敏感性；结合各种电泳技术提高对抗原分析的分辨能力，结合激光共聚焦显微镜、电子显微镜进行亚细胞水平、染色体、甚至分子水平上的定位