免疫组化技术常见问题及处理方法

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1、免疫组化技术常见问题及处理方法免疫组织化学的定义用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术免疫组织化学的原理根据抗原抗体反应和化学显色原理组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合利用一抗与标记生物素（HRP、AKP）、荧光素等的二抗进行反应通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成分的分布和含量免疫组织化学的分类按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标

2、记、荧光标记和放射性标记等按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法；亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高的组织抗原检测可被检测的物质组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶

3、、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测免疫组织化学的特点1）特异性强2）敏感性高3）定位准确、形态与功能相结合Westernblotting、ELISA与免疫组化的异同Westernblotting：蛋白质免疫印迹，检查组织或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位，但敏感性远远低于免疫组化技术ELISA：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一免疫组织化学方法的基本步

4、骤组织和细胞的处理抗原修复染色鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）鼠单克隆抗体特异性较高背景较干净有多种潜在用途但敏感性、亲和力低兔多克隆抗体（兔抗血清）高敏感性、亲和力可能有较多的交叉反应更多的潜在用途SP法1.石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。2.根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。3.每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分钟。4.除去PBS液，每张切片加1滴或5

5、0μl正常非免疫动物血清(试剂B)，室温下孵育10分钟。5.除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min，PBS冲洗3次，每次3分钟。6.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。7.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。8

6、.除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液，显微镜下观察3-10分钟。9.自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。二步法(Envision系统)1）脱蜡、水化组织切片。2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧化物酶，PBS或TBS冲洗。4

7、）滴加一抗，室温或37℃孵育30-60分钟，或4℃过夜，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。5）滴加enhangcer增强剂（试剂A），37度30min，PBS或TBS浸洗3分钟×5次。6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37℃孵育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。7）应用DAB溶液显色。8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。Envision系统的优点敏感性高背景干净（消除内源性生物素的干扰）步骤简单石蜡切片标本的固定1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好2

8、、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗原决定簇的暴露，产生阴性结果4、固定液的量要超过组织体积5倍以上如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失固定不充分标本的取材、脱水、浸蜡标本的取材厚度以2mm为宜梯度酒精脱水尽量彻底充分二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组织发硬发脆浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出