综合性设计性实验-3

《综合性设计性实验-3》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、综合性设计性实验-3蛋白质翻译后修饰位点预测醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分离血红蛋白和细胞色素C目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定此实验共包括如下三个部分第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳第三部分，目标蛋白的2D电泳分离分析及其生物质谱鉴定第一部分，蛋白质翻译后修饰位点预测泛素化对于细胞分化与凋亡、DNA修复、免疫应答和应激反应等生理过程起着重要作用；磷酸化涉及细胞信号转导、神经活动、肌肉收缩以及细胞的增殖、发育和分化等生理病理过程；糖基化在许多生物过程中如免疫保护、

2、病毒的复制、细胞生长、炎症的产生等起着重要的作用；脂基化对于生物体内的信号转导过程起着非常关键的作用；组蛋白上的甲基化和乙酰化与转录调节有关。蛋白质翻译后修饰在生命体中具有十分重要的作用。它使蛋白质的结构更为复杂，功能更为完善，调节更为精细，作用更为专一。常见的蛋白质翻译后修饰过程有泛素化、磷酸化、糖基化、脂基化、甲基化和乙酰化等。甘露糖化修饰预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCGlyc/N位糖基化修饰预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc

3、/O位糖基化修饰预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/豆蔻酰化位点预测：http://www.expasy.org/tools/myristoylator/乙酰化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetAcet/磷酸化位点预测：http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/以NGAL蛋白为例的磷酸化修饰位点预测结果电泳的含义带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。电泳的应用

4、1.分离各种有机物：如蛋白质、酶、核酸等2.分析某种物质的纯度及分子量第二部分，醋酸纤维薄膜电泳和等电聚焦电泳电泳的基本原理在电场中，推动带电质点运动的力（F）等于质点所带净电荷量（Q）与电场强度（E）的乘积。F＝QE质点的前移同样要受到阻力（F）的影响，对于一个球形质点，服从Stoke定律，即：F′＝6πrην（r为质点半径，η为介质粘度，ν为质点移动速度）当质点在电场中作稳定运动时：F＝F′即：QE＝6πrην在同一电泳条件下，不同的物质因其分子大小（r）和带电量（Q）的差异而具有不同的泳动速度，因此，电泳一定的时间（t

5、）就可互相分离。EqfqEghnπ6==待分离大分子的性质：所带的电荷、分子大小和形状。分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。电场强度：过高，产热，蛋白变性导致不能分离；缓冲液水分蒸发过多，离子强度增加；虹吸现象等。过低，电泳时间增加，扩散。当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置。电渗：在电场中液体对固体支持物的相对移动；当电渗方向与电泳方向一致时，会加快颗粒泳动速度，反之，当两者方向相反时，会减慢颗粒泳动速度。支持介质的筛孔：筛孔越小，则颗粒在移动的过程中所受到的阻力也就越大。缓冲

6、液pH和离子强度：pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大；但是pH过高或过低引起蛋白变性，缓冲液通常要保持一定的离子强度；强度过低，则缓冲能力差，不易维持PH恒定，离子强度过高，在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），降低了蛋白质的带电量，使电泳速度减慢。一般所用离子强度为0.02～0.2之间。电泳的影响因素血清蛋白醋酸纤维膜电泳实验目的掌握醋酸纤维膜电泳的基本原理及其临床意义熟悉电泳仪器的使用和操作+白蛋白(A)α1α2βγ血清蛋白的pI大多在7.5以下，在pH8.6的巴比妥

7、缓冲液中以负离子形式存在，并且蛋白质的分子量、立体构象、等电点以及形状也有差异，在电场中迁移速度不同，可以在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β和γ五条区带。蛋白名称等电点分子量白蛋白4.8869000α5.06α1：20000α2：30000β5.1290000-150000γ6.85-7.50156000-300000醋酸纤维素（二乙酸纤维素）薄膜具有匀一的泡沫状结构，渗透性强，对分子移动无阻力，用它作区带电泳的支持物，具有用样量少，分离清晰，无吸附作用。目前可用于血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、酶的分离和免疫电泳等方面。醋

8、酸纤维素薄膜经1,4－二氧六环、透明液或液体石蜡处理即透明，因而可得背景为无色的电泳图谱。醋酸纤维素薄膜的特性实验操作及注意事项膜的预处理：将薄膜切成2.5×8cm，无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上，膜条自然浸湿下沉。取充分浸透的膜条，滤纸吸取多余的缓冲液，不要弄太干。加样：光面用铅笔