工业微生物育种论文

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1、紫外诱变大肠杆菌青霉素抗性突变株筛选摘要：人工诱变微生物育种具有速度快、收效大的优点，在生产和科研中被广泛应用。常规的微生物育种技术主要分为物理诱变、化学诱变、生物诱变三种。为了得到大肠杆菌链霉素抗性突变株，本设计采用物理诱变中紫外诱变的方法，并对得到的菌种进行筛选，从而获得对青霉素有较高抗性的大肠杆菌的突变株。关键词：紫外诱变大肠杆菌青霉素抗性突变株紫外线的波长在200~380nm之间，但对诱变最有效的波长仅仅是在253~265nm，一般紫外线杀菌灯所发射的紫外线大约有80%是254nm。紫外线诱变的主要生物学效应是由于DNA变化而造成的，DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其

2、是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链的断裂、碱基破坏。但其最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。经紫外线损伤的DNA，能被可见光复活，因此，经诱变处理后的微生物菌种要避免长波紫外线和可见光的照射，故经紫外线照射后样品需用黑纸或黑布包裹。另外，照射处理后的孢子悬液不要贮放太久，以免突变在黑暗中修复。切补修复：DNA修复机制之一。认为是经过下列四步酶促反应完成的。（1）由能识别损伤部位的特异内切核酸酶在损伤部位附近打开缺口；（2）外切核酸酶将损伤部分从DNA切除；（3）以

3、未受损伤一方的DNA单链作模版，修复填补损伤链中切除产生的缺口；（4）由连接酶把修复好的DNA部分与原有的DNA接上，成为完整的DNA。目前催化该反应的酶制剂已从微生物分离成功。现知作为人体多发性皮肤癌遗传病的色素性干皮病患者的表皮细胞切补修复能力低，在上面的（1）—（3）的反应中，某一步反应不正常。所需菌种为大肠杆菌；所需培养基（完全培养基）为肉膏蛋白胨培养基（牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、NaCl0.5g、水100mL、pH=7.2、100KPa、121℃高压蒸汽灭菌20min、琼脂1.5%～2%。）主要药品：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、可溶性淀粉、青霉素。主要器皿：试管3

4、0支、移液管1mL10支、5mL3支、10mL1支、锥形瓶10个、量筒、烧杯、培养皿30个、离心管、20W紫外灯、磁力搅拌器、离心机、紫外诱变箱等。菌种介绍：大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。正常栖居条件下不致病。但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道中大量繁殖，几

5、占粪便干重的1/3。兼性厌氧菌。在环境卫生不良的情况下，常随粪便散布在周围环境中。若在水和食品中检出此菌，可认为是被粪便污染的指标，从而可能有肠道病原菌的存在。因此，大肠菌群数（或大肠菌值）常作为饮水和食物（或药物）的卫生学标准。（国家规定，每升饮用水中大肠杆菌数不应超过3个）大肠杆菌的抗原成分复杂，可分为菌体抗原（O）、鞭毛抗原（H）和表面抗原（K），后者有抗机体吞噬和抗补体的能力。根据菌体抗原的不同，可将大肠杆菌分为150多型，其中有16个血清型为致病性大肠杆菌，常引起流行性婴儿腹泄和成人肋膜炎。大肠杆菌是研究微生物遗传的重要材料，如局限性转导就是1954年在大肠杆菌K12

6、菌株中发现的。莱德伯格（Lederberg）采用两株大肠杆菌的营养缺陷型进行实验，奠定了研究细菌接合方法学上的基础，以及基因工程的研究。实验设计内容：1.出发菌株把大肠杆菌斜面培养到对数期，以便得到大量的大肠杆菌。2.前培养出发菌株移接新鲜斜面培养基，以肉汤为主，适量加入核酸类物质或酵母膏等制成营养丰富的培养基，同时还可以加入抑制修复的物质，如咖啡碱或异烟肼等。37℃培养16～24h，将菌体培养到最佳生理状态，利于诱变。3.菌悬液的制备取已培养20h的活化大肠杆菌斜面一支，用10mL生理盐水将菌苔洗下，取4mL于5mL离心管中离心(3000r/min)15min，弃上清液，将菌

7、体用无菌生理盐水洗涤2次，最后制成菌悬液并倒入盛有玻璃珠的锥形瓶中，强烈振荡10min，以打碎菌块，用无菌滤纸活脱脂棉过滤使之形成单菌悬液。菌悬液浓度为为108/mL。4.平板制作将肉膏蛋白胨培养基熔化后，冷至45℃左右倒平板。待平板完全冷却后，取0.1mL链霉素用无菌棒涂布于平板上。其中留三块平板不涂布链霉素作为对照。5.诱变处理(1)预热正式照射前开启紫外灯预热30min。(2)搅拌取制备好的菌悬液5mL移入6cm的无菌培养皿中，放入无菌磁力搅拌捧，置磁力搅拌器上，20W紫外灯下30cm