浅谈论桂枝茯苓丸对荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡的影响

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1、浅谈论桂枝茯苓丸对荷瘤鼠肿瘤细胞凋亡的影响　　论文：桂枝茯苓丸；凋亡；SurvivinmRNA　　论文：目的：探索桂枝茯苓丸诱导肿瘤细胞凋亡机制，为桂枝茯苓丸(GFPUS显微镜(日本)、HITACHI－H500型透射电镜(德国菲利蒲公司)、FACSCALIBUR流式细胞仪(美国BD公司)、SB651旋转蒸发仪(日本RIKAKI公司)、HIMAS－2000多媒体彩色病理图文分析系统(同济医大)。　　1．2　实验动物　40只昆明小鼠，体重(20±2)g，雄性，由齐齐哈尔医学院实验动物中心提供。　　1．3　瘤株S180瘤株，由黑

2、龙江省肿瘤探究所提供　　1．4　药物　桂枝茯苓丸：按《金匮要略》记载标准，生药均购自齐齐哈尔市中医院。桂枝、茯苓、桃仁、牡丹皮、赤芍各药等量，加适量水，浸泡2h，先文火后武火煎煮2次，经过滤除渣后，水浴浓缩，配成1g/mL的水煎剂，置4℃保存备用。　　环磷酰胺(Cylophosphamide，CY)，山西普德药业有限公司出品，批号H14023686。　　1．5　动物模型　取腹腔接种10天的荷瘤小鼠，在无菌条件下抽取腹水(乳白色，黏稠)，放进无菌容器内，置冰块保存。用0.4％台盼蓝生理盐水液计数(计活细胞大于95％)，用生理

3、盐水调细胞浓度至5×106/mL。取KM小鼠30只，每只鼠右侧腋下皮下注射0.2mL瘤细胞悬液。　　1．6　动物分组及给药方法　将荷瘤鼠随机分为3组，每组10只，分别为模型组、实验组、CY组，另取10只未荷瘤小鼠作为正常对照。模型组(Modelgroup)：生理盐水灌胃0.2mL/(10g·d)；中药组(GFL/(10g·d)；环磷酰胺组(CYgroup)：腹腔注射CY20mg/(kg·d)。接种后越日给药，各组天天给药1次，连续10天。　　1．7　细胞凋亡的检测(流式细胞仪－单激光单染色法)小鼠脱颈正法，无菌取腋下实体瘤

4、，常规制备瘤细胞悬液，调整浓度1×106/mL，1500r/min离心5min，弃上清，PBS洗1次，加70％冷乙醇1mL,4℃固定30min。离心5min，弃上清，PBS洗2次。加50mg/mLPI染液600mL染色，30min后上机测定。　　1．8　透射电镜观察形态学改变　每组随机取2块瘤组织，将瘤组织快速投进2.5％戊二醛固定液固定2h以上，磷酸缓冲液漂洗，1％锇酸后固定1－2h，缓冲液漂洗20min，丙酮梯度脱水，浸透、包埋、制备超薄切片，醛酸双氧铀和柠檬酸铅染色，电镜观察并拍片。　　1．9　原位杂交瘤组织及时固定

5、，切片常规脱蜡至水。3％H2O2室温封闭10min，PBS洗，暴露mRNA核酸片断，滴加预杂交液20μL，40℃3h，不洗，Survivin探针杂交液20μL，滴加40℃杂交过夜，杂交后洗涤，滴加生物素化抗地高辛37℃60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，滴加高敏过氧化物酶链亲和索复合物工作液，37℃60min，原位杂交用PBS洗5min×4次，DAB显色，苏木素复染，常规酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。本实验设2张阴性对照片，1张用PBS代替探针，1张用PBS代替生物素化抗地高辛。　　1．10　统计方法　Su

6、rvivin结果利用HIMAS－2000多媒体全自动图像分析仪检测，所得数据经SPSS11.0系统处理，采用OneAS－2000多媒体图像分析系统对Survivin各组原位杂交反应阳性细胞面密度值、阳性细胞均匀灰度值进行分析。和模型组比较，GFRNA表达降低(P＜0.01)，GFRNA表达差异无统计学意义(P＞0.05)。提示GFRNA量。　　　　3　讨　论　　通过应用各种不同的药物影响信号传导途径，从而触发或重建整个死亡程序，使处于封闭状态的凋亡信号传导各效应环节迅速连通，诱导程序化细胞死亡反应，为肿瘤治疗开辟了新思路。

7、细胞凋亡信号传导的大致过程是：细胞整合各种胞内外凋亡信号，通过细胞凋亡信号和其受体形成的复合物经胞浆信号转导蛋白传递至一组细胞凋亡的执行者caspases，再由激活的easpases对其特异性底物进行降解，终极导致细胞凋亡。本实验经流式细胞仪检测表明，GFRNA，结果显示SurvivinmRNA在模型组中高表达，表明在肿瘤细胞中该基因转录功能增强，基因蛋白天生后，通过破坏凋亡平衡参和肿瘤细胞发生发展。和模型组比较，GFRNA表达降低(P＜0.01)，表明GFPoNA的转录水平的功能，提示桂枝茯苓丸可通过影响Survivin

8、表达促进肿瘤细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞生长。　　综上所述表明GFW具有诱导肿瘤细胞凋亡功能，其分子机制和Survivin表达有关。而肿瘤是多基因异常所致疾病，桂枝茯苓丸抑制肿瘤生长在基因水平的功能是对上述基因特异的功能，或是对多种癌基因和抑癌基因非特异功能有待进一步探究。