骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的实验研究PPT课件.ppt

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1、骨髓间充质干细胞移植治疗心力衰竭的实验研究研究生：导师：一、研究背景心肌病、难治性心力衰竭等心血管疾病仍严重威胁着人类的生命。各种心肌疾病→心肌缺血、坏死→有功能的心肌细胞、心肌组织↓→纤维组织增生、取代→形成瘢痕组织→进行性的心收缩功能不良、心腔扩张和心力衰竭。内科治疗：不能替代坏死心肌；心脏移植：供体少、费用高→难以推广细胞移植：带来了新的曙光骨髓间充质干细胞（MSC）分化：（1）心肌细胞（2）内皮细胞（3）平滑肌细胞优点：(1)自体移植，不存在免疫排斥问题。(2)MSCs定向分化的能力较强(3)来源广，容易获取。(4)不存在伦理道德上的争议。现有

2、的研究已证实，MSCs移植→减少梗死面积改善心功能增加新生血管形成二、研究目的分离纯化骨髓间充质干细胞，探讨骨髓间充质干细胞移植对阿霉素诱导的心力衰竭大鼠心功能的影响。三、材料与方法动物：具有同基因背景的近交系F344大鼠药品及试剂：注射用盐酸阿霉素、淋巴细胞分离液、胎牛血清、低糖DMEM培养基、胰蛋白酶、5-溴-2′脱氧尿苷(BrdU)、小鼠抗大鼠Brdu单克隆抗体、SP法试剂盒、浓缩型DAB试剂盒、小鼠抗大鼠单抗CD11b/c-FITC、CD34-FITC、CD44-PE和CD90-PE，以及相应同型对照单抗小鼠IgG1-FITC、IgG1-PE、

3、IgG2a–PE和IgG2a–FITC等设备及器械：BCM-1000型生物洁净工作台、37℃恒温CO2培养箱、倒置相差显微镜、－70℃超低温冰箱、LXJ－Ⅱ离心机、RM6240型生物信号采集分析系统、YP100型压力换能器、流式细胞仪等实验路线1：细胞部分实验路线2：动物实验F344大鼠ADR注射细胞移植组心功测定＋组化分析细胞移植DMEM注射移植对照组NS注射F344大鼠正常对照组（一）实验动物分组及心力衰竭模型建立1.随机选取10只大鼠作为正常对照组（NS腹腔注射）2.其余36只大鼠，采用腹腔注射阿霉素（2mg/kg，每周一次，共六次）建立心力衰竭

4、模型3.存活大鼠再随机分为2组：移植对照组、细胞移植组（二）MSCs的分离及培养：1.将F344大鼠处，无菌条件下获取股骨和胫骨，用培养液冲洗骨髓腔，获取全部骨髓细胞2.采用淋巴细胞分离液进行分离纯化3.细胞以1×104/cm2的密度接种于培养瓶，置培养箱内培养4.48h后首次换液,以后约3－4天换液一次5.待细胞生长至铺满瓶壁的2/3以上时，进行消化、传代（三）、MSCs的鉴定：1.倒置显微镜下观察MSCs的形态。2.MSCs的流式细胞仪鉴定：检测MSCs细胞表面抗原CD11b/c、CD34、CD44和CD90的表达第3代MSCs消化离心洗涤滤过一抗

5、孵育离心洗涤上机检测（四）、MSCs的标记：1.BrdU储存液的配制：将10mgBrdU、0.8mL二甲基亚砜和1.2mL蒸馏水充分混匀，4℃避光保存。2.移植前，待细胞达到50％融合时，在细胞培养瓶内加入上述BrdU液，终浓度调至50mg/L，于37℃、含5％的CO2的饱和湿度培养箱内继续培养48h。（五）、MSCs的BrdU标记率检测：第3代MSCs细胞爬片BrdU孵育48hPBS甲醛固定3%H2O2灭活内源性酶酸变性胰酶修复非免疫血清封闭液PBS（阴性对照）一抗1：200生物素化二抗SABCDAB显色蒸馏水蒸馏水蒸馏水、PBSPBSPBSPBS苏

6、木素复染（阴性对照）PBS蒸馏水（六）、MSCs移植：1.细胞移植组：大鼠腹腔阿霉素末次注射后1周，将标记好的MSCs50μl（细胞数3×106），从股静脉缓慢注入。2.移植对照组：股静脉缓慢注入DMEM培养基50μl。3.正常组不做任何处理。（七）、大鼠心功能的测定：仪器准备、参数调节大鼠麻醉、固定去毛、切开皮肤手术分离右颈总动脉插入自制心导管缓慢推进至左心室稳定后测量LVSP、LVDP、HR及±dP/dtmax（八）、MSCs移植后的心脏归巢检测：心脏甲醛固定酒精脱水、石蜡包埋切片脱蜡、水化3%H2O2灭活内源性酶酸变性胰酶修复非免疫血清封闭液PB

7、S（阴性对照）一抗1：200生物素化二抗SABCDAB显色蒸馏水蒸馏水、PBSPBSPBSPBS固绿复染PBS蒸馏水透明封片（九）、统计分析所得的数据用均数±标准差（mean±SD）表示SPSS10.0统计软件处理数据多个样本均数比较采用oneway-ANOVA检验P﹤0.05表示有显著性差异。四、结果MSCs贴壁生长示意图其余结果略，呵呵！五、讨论心肌损伤、舒缩功能障碍心力衰竭阿霉素心肌损害机制阿霉素诱导的心衰模型成功构建判定指标：①行为表现②肝淤血③心功能（LVSP、LVEP、±dP/dtmax）本研究发现从开始腹腔注射阿霉素第2周起，造模组大鼠即

8、开始出现程度不等的中毒症状，表现为精神委靡，腹泻，皮毛松软失去光泽，活动、进食减少，体重减轻等