绿色荧光蛋白(gfp)基因的克隆、表达和粗提取

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1、绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取南方医科大学2011预防医学（卫生检验检疫）摘要目的：研究绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。方法：从E.coliDH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝

2、胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coliBL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。关键词：绿色荧光蛋白基因克隆重组表达转化粗提取17目录1前言32实验目的43实验设备44材料及试剂55实验操作步骤55.1操作流程55.2质粒DNA的分离与纯化65.2.1质粒的培养65.2.2质粒的

3、DNA的碱提取法65.2.3质粒DNA的鉴定与纯化75.3酶切及连接85.3.1双酶切85.3.2回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）85.3.3连接95.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化95.4.1LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录）95.4.2．感受态细胞的制备(CaCl2法)95.4.3转化涂板105.5GFP蛋白的诱导表达10175.6绿色荧光蛋白的粗提取11参考文献11附录121LB培养基的配制：122.溶液Ⅰ123.溶液Ⅱ124.溶液Ⅲ（100ml）

4、125.DNase-freeRNaseA136.TE缓冲液（pH8.0）137.20×TBE138.GeneFinder-溴酚蓝上样缓冲液139．PEGFP-N3质粒全图谱1310．pET-28a质粒全图谱141前言绿色荧光蛋白（greenfluorescentprotein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发

5、现一种绿色的荧光蛋白。1974年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1]GFP作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP17分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；④GFP不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定

6、位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[2～3]。采用GFP作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[4、5]。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6]。质粒转化进入大肠杆菌（Escherichiacoli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态细胞的制备

7、主要采用CaCl2法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[9]。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的

8、蛋白质表达系统[10]。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株[11]。随着科研的进展，构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株，以满足表达不同性质、要求的目的基因的需要。在原核细胞中表达蛋白质的载体常用启动子有T7启动子、Trp启动子-色氨酸启动子、Tac启动子、T7噬菌体中基因10的启动子及Lac启动子等。Lac启动子受分解代谢系