猪受精及早期胚胎发育相关因子的筛选与功能解析

《猪受精及早期胚胎发育相关因子的筛选与功能解析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、摘要摘要一例试管婴儿出生随着第，辅助生殖技术（ＡＲＴ）己经引起了越来越多的关注，但是其效率依然非常低下，所以，探索受精和早期胚胎发育的过程和机制显得尤为重要。猪作为最重要的大型哺乳动物生物医学模型之一生殖调控研究既可作为人类生殖生理和病理过程，其研究的参考，又可提供供体器官用于人类器官移植，因此我们对猪的受精和早期胚胎发育过一程进行研究，来增加人们对其的认识。大量实验证明些蛋白质和基因在生殖进程中发挥着重要作用，如卵母细胞成熟，受精，合子基因激活以及胚胎发育，。随着高通量组学的发展人们己

2、经发现了许多特异性表达的蛋白和转录本，然而如何筛选出对受精与胚胎发育有重要－ｌ作用的因子是我们急需解决的问题。最近长链非编码ＲＮＡ（ｏｎｎｏｎｃｏｄｉｎＲＮＡｓ，ＩｎｃＲＮＡｓ）ｇｇ的研宄正引起人们的广泛关注，丨ｎｃＲＮＡ可以在多个层次上调控基因表达，参与机体的各种正常生理过程，并与多种疾病有密切关连，但其在哺乳动物早期胚胎发育上的功能机制尚未阐明，对猪早期胚胎中表达的ＩｎｃＲＮＡ更是缺乏完整系统的鉴定和研究。故在本研究中，我们试图在蛋白和ＩｎｃＲＮＡ两个方面对生殖发育过程进行探索。研宄报道从

3、卵的生发泡破裂到合子基因组激活（猪为４细胞期，小鼠为２细胞期，人为４细胞期）之前，基因组没有或只有极少的转录活性。考虑到ＩｎｃＲＮＡ转录的时空特异性，故我们拟对体外受精和胚胎基因激活后发育分别进行关键蛋白和ＩｎｃＲＮＡ的筛选和功能研究。主要研究结果如下：（１）通常情况下我们用体外成熟４２ｈ的卵母细胞（４２０）进行体外受精，但在前期工作中，我们已经证明了体外成熟３３小时的卵母细胞（３３０）己经达到了核成熟。我们的研究发现，３３０体外受精的受精率，精子解聚率，原核形成率，卵裂率以及囊胚率都要显著高于

4、４２０。通过蛋白质组学比较３３０和４２０共得到了１８个差异表达蛋白，其中１１个在４２０中富集，７个在３３０中富集。生物信息分析显示，差异蛋白主要富集于卵母细胞成熟，染色体重塑，表观修３３饰，胚胎发现等方面０拥有更好的体外受精发育潜能与其特异的蛋白成分密切相。这表明关，所以我们从３３０中高表达的蛋白入手进行特异性蛋白的功能研宄。（２）我们通过对Ｍｉｌ卵注射ＰＤＩＡ３抗体或ＰＤＩＡ３的ｍＲＮＡ来实现对母源ＰＤＩＡ３的扰低和过表达，。结果显示当母源蛋白的表达受到抑制后受精胚胎中精子解聚率显著降低，相

5、反，过表达ＰＤＩＡ３会促进精子解聚。另外，我们发现，当采用ＤＴＴ预处理的精子对ＰＤＩＡ３干扰组进行ＩＳＣＩ后，其精子解聚率恢复正常水平。这些结果表明母源ＰＤ１Ａ３可能是通过清除鱼精蛋白二硫键在精子解聚过程中发挥功能。（３）由于猪上基因注释非常不完整，导致目前很少有研究在猪上大量预测ＩｎｃＲＮＡ，其与早期胚胎发育的关系的研究更是少之又少。本研究从公共数据库中下载了０３个猪各组织的转录组测序数据，用非依赖序列注释的编码能力预测软件（ＣＮＣＩＰＡＴ）、Ｃ预测其编码能力，共获得了４７７６个新

6、的ＩｎｃＲＮＡ。加权基因共表达网络分析（ＷＧＣＮＡ）显示每个发育时期都拥有与其显著相关的共表达基因模块一。我们利用同模块中己知基因的功能富集性分析（ＧＯ）一来预测其对应的ＩｎｃＲＮＡ的功能，富集结果符合胚胎发育各时期所需要的功能。本研究第次利用基于序列信息预测ＩｎｃＲＮＡ的方法对猪ＩｎｃＲＮＡ进行了综合分析，并首次对猪ＩｎｃＲＮＡ与早期胚胎发育的关系进行了研究。Ｉ东北农业大学理学博士学位论文－至－－（４）研宄显示猪的合子基因组激活发生在４８细胞阶段，故我们在４细胞对应的模块中挑选了２个

7、排名较高的ＩｎｃＲＮＡ的功能进行了初步探索。通过ＰＣＲ及测序结果的比对分析确定了我们预测的ＩｎｃＲＮＡ的准确性。通过链特异性逆转录ＰＣＲ确定了我们预测的ＩｎｃＲＮＡ转录方向。通过特异性的引物进行ＰＣＲ我们发现具有２种可变剪切。ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ－－实验表明，和ｒｃｃｗｙｊｗｉｕ似５Ｊ都是４细胞至桑葚胚特异性表达，并在８细胞转录水平达到最高。通过注射特异性的锁核酸对两个ＩｎｃＲＮＡ分别进行千扰，２种ＩｎｃＲＮＡ的一４－干扰均导致了胚胎无法发育至囊胚，多阻滞于细胞时期，其中幻７０的个锁核酸片段

8、干扰导致胚胎无法卵裂。关键词：受精；早期胚胎发育：蛋白质组；ＰＤＩＡ３；精子解聚；长非编码ＲＮＡＩＩＡｂｓｔｒａｃｔＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＫｅｙＦａｃｔｏｒｓｔｏＰｏｒｃｉｎｅＦｅｒｔｉｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄＥｍｂｒｙｏｎｉｃＤｅｖｅｌｏｐｍｅ