血液中大肠埃希菌超广谱β

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1、血液中大肠埃希菌超广谱β【关键词】大肠埃希菌；超广谱β-内酰胺酶；基因型；血液标本　　Abstract:ObjectiveToinvestigatetheisolationrate,antibioticsusceptibilityandESBLs′genotypesoftheEscherichiacolistrainsisolatedfromlocalbloodsamples.Methods26clinicalstrainsofE.ColiexpressingESBLsisolatedfrombloodpCandGESgenesinedbyDNAsequencing.Resu

2、ltsThereong26strains.ConclusionResultsshoinantgenotypesofESBLsinE.colistrainsisolatedfromlocalbloodsamples.　　Keyple　　超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum-laetamases，ESBLs)主要由肠杆菌科的细菌产生,以大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌为代表［1］，是临床肠杆菌科细菌对第三代头孢菌素耐药的重要机制。ESBLs型细菌对多种抗生素耐药,易引起医院院内暴发流行，血液中一旦出现产ESBLs的大肠埃希菌，可引起多器官甚至全身感染，给临床治疗带来极大

3、困难，因此进行本地区临床血液标本中分离的ESBLs型菌的耐药性监测及耐药分子流行病学研究，对血液流行感染性疾病的预防控制尤为重要。由于抗生素使用情况差异，不同国家、地区ESBLs种类不同，国内报道以SHV和CTX-M型较为常见［2-3］，为了解本地区血流感染ESBLs型大肠埃希菌的耐药情况，对宁夏医科大学附属医院2005年1月至2008年5月临床血液标本分离的26株ESBLs阳性菌株耐药性和基因型报告如下。　　1材料　　1.1菌株　　临床血液标本中连续分离出无重复（同一患者同一部位只取第一次分离标本）26株ESBLs阳性菌株。　　1.2主要试剂　　分离鉴定培养基、M-H琼脂干

4、粉和药敏纸片（英国Oxoid公司）；2000DNAMarker、蛋白酶K、TakaraTag酶（大连宝生物公司）；引物由上海生物工程公司合成。　　1.3主要仪器　　VITEK-32全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司）；DB-920全自动血培养仪；ND-1000核酸蛋白测定仪（美国NanoDrop公司）；EppendorfPCR仪（德国）；电泳仪、凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）。　　2方法　　2.1菌株鉴定　　所有菌株采用法国生物梅里埃公司VITEK-32全自动微生物分析仪鉴定及药敏试验鉴定菌种，得到初步ESBLs的结果。　　2.2ESBLs确证试验　　采用美国

5、临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的纸片扩散法进行ESBLs表型确证［4］，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。　　2.3药敏试验　　按K-B法将待测菌液接种M-H平皿上，贴上抗生素纸片，35℃培养18-24h，测量抑菌圈直径，按CLSI标准判断敏感率(S)、中介率（I）、耐药率(R)，共采用15种抗生素。　　2.4细菌质粒DNA的提取　　采用传统的煮沸法提取质粒DNA［5］，调整菌液的浓度使得OD260/OD280在0.4～0.6之间，作为模板液备用。　　2.5设计靶基因PCR扩增反应体系　　总反应体积25μL，其中10×buffer2.5μL，dNTP4μL，pr

6、imer0.6×2μL，TaqE0.4μL，模板1μL，用ddH2O补足至25μL。热循环参数为:预变性(94℃10min)→变性（94℃30s）→退火→延伸（72℃60s）,循环35周期,最后1个72℃延长至5min。反应的退火温度根据每对上下游引物单独设计。靶基因PCR引物序列由上海生物工程公司合成（引物序列见参考文献［6］）。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后,用溴化乙锭(10mg/mL)染色，凝胶成像系统进行结果分析。各种靶基因引物序列和目的产物长度见表1。　　2.6PCR产物的基因测序　　随机抽取各基因型阳性菌株2株，用美国应用生物系统公司ABI377自动DN

7、A测序仪进行序列分析(由北京诺赛基因测序公司完成)。DNA测序结果通过美国NCBI网站BLASTN软件与GenBank数据库进行比对分析。表1β-内酰胺酶引物序列（略）　　3结果　　3.1耐药率　　26株产ESBLs酶的大肠埃希菌对15种抗菌药物耐药率的分析，见表2。表226株产ESBLs菌株对15种抗生素的耐药情况（略）　　3.2基因型检测结果　　26株产ESBLs大肠埃希菌基因型检测结果，见表3。ESBLs的CTX-M、TEM基因型的PCR凝胶电泳见图1。表326株产ESBLs大肠埃希菌基因型检测结