高效液相色谱法测定卡介菌多糖核酸中苯酚残留量

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1、高效液相色谱法测定卡介菌多糖核酸中苯酚残留量【】目的采用高效液相色谱法测定卡介菌多糖核酸注射液中苯酚的残留量。方法色谱柱C18ODS柱（250×4.6mm，5μm）。流动相：水-甲醇（50：50V/V），流速为1ml·min-1；检测波长为270nm，柱温为25℃；进样量：10μl。结果在5μg/ml-25μg/ml间，苯酚峰面积与浓度的线性方程为Y=9.2766X-0.3115（r=0.9994），线性关系良好，检测限为0.04μg/ml，且卡介菌多糖核酸中苯酚能得到良好分离，重现性好。结论本方法快速简单，结果准确，灵敏度高，且无污染。　　【关键词】高效液相色谱；苯酚

2、；卡介菌多糖核酸　　卡介菌多糖核酸（BCG-PSN）是采用热酚法去除蛋白质，研制成的新一代卡介菌提取物，临床上广泛用于预防和治疗感冒、哮喘、慢性气管炎、病毒感染性疾病、自身免疫性疾病[1]。　　该疫苗在制备过程中，使用有机溶剂苯酚。苯酚是最简单的酚，为无色固体，有特殊气味，呈酸性，早期用气相色谱法或溴化容量法可分别测定各种酚类，由于操作过程繁琐，应用受到一定限制。本文根据《中国药典》三部（2010版）对生物制品的质量控制要求[2]，采用高效液相色谱法测定卡介菌多糖核酸中苯酚残留量[3]，该方法灵敏度高、精密性好。　　1材料与方法　　1.1药品与试剂卡介菌多糖核酸注

3、射液、苯酚、无水乙醇、甲醇。　　1.2主要仪器高效液相色谱仪、电子天平、超声仪。　　1.3溶液制备　　1.3.1对照品溶液取苯酚适量，精密称定。置200ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释定容，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取储备液适量，加乙醇稀释为0-20μg/ml浓度的线性对照溶液。　　1.3.2供试品溶液精密取卡介菌多糖核酸注射液0.5ml，置2ml离心管中，加乙醇1ml，超声5分钟，16000rpm离心5分钟，精密量取上清液作为供试品溶液。　　1.4色谱条件色谱柱C18ODS柱（250×4.6mm，5μm）。流动相：水-甲醇（50：50V/V），流速为1ml·min-

4、1；检测波长为270nm，柱温为25℃；进样量：10μl。　　1.5方法的线性关系考察取苯酚约10mg，精密称定，置200ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。分别精密量取储备液适量，加乙醇分别稀释成5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml的系列标准溶液，记录色谱图。以对照品浓度为横坐标μg/ml，以峰面积为纵坐标，进行线性回归。　　1.6检测限确定取苯酚对照品溶液，加乙醇分别稀释成5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml系列的供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行测试分析，确定可检测出的

5、最低水平作为检测限。　　1.7精密度试验重复性试验的确定取苯酚对照品溶液，连续进样6次，通过检验数据表明方法的重复性能达到试验的要求。　　1.8卡介菌多糖核酸注射液进行苯酚残留量检查按照经验证的苯酚残留量检测方法，对三批卡介菌多糖核酸注射液的苯酚残留量进行测定，批号：K20101001、K20101002、K20101003，取注射液0.5ml置2ml离心管中，加乙醇定容至1ml，超声5分钟，16000rpm离心5分钟，精密量取上清液作为供试溶液。精密量取供试品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，将苯酚色谱峰峰面积代入线性方程，计算卡介菌多糖核酸注射液中苯酚的残留量。　　2结果　　2

6、.1方法线性关系通过试验表明，对照品在5μg/ml-25μg/ml浓度之间，苯酚浓度与峰面积有很好的线性关系。　　2.2方法检测限通过对苯酚不同浓度的检查，最低检测限值为0.04μg/ml，见表1。　　2.3方法的精密性苯酚保留时间为6.571min，保留时间的RSD为0.48%；峰面积为，峰面积的RSD为1.43%，均小于2%，表明该方法重复性及重现性良好，见表2。　　2.4样品测定证明卡介菌多糖核酸注射液中苯酚残留量符合要求，见表3。　　3讨论　　采用无水乙醇提取，高效液相色谱法对卡介菌多糖核酸注射液中苯酚残留量的测定研究。该方法线性关系好、灵敏度高、重现性好（峰面积的RSD均

7、小于2%），为卡介菌多糖核酸中苯酚残留量的测定建立了一种灵敏、简单方便、应用范围广的方法。　　【】目的采用高效液相色谱法测定卡介菌多糖核酸注射液中苯酚的残留量。方法色谱柱C18ODS柱（250×4.6mm，5μm）。流动相：水-甲醇（50：50V/V），流速为1ml·min-1；检测波长为270nm，柱温为25℃；进样量：10μl。结果在5μg/ml-25μg/ml间，苯酚峰面积与浓度的线性方程为Y=9.2766X-0.3115（r=0.9994），线性关