实验2：分离以尿素为氮源的微生物

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1、实验2分离以尿素为氮源的微生物思考：采用什么方法从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物？如何判断分离出的细菌确实能将尿素分解？一.实验原理尿素NH3中性碱性酚红颜色：(酸性)黄色红色(变色范围pH6.4-8.2)二.实验目的使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶)通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pH的变化(脲酶催化的化学反应)以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中尿素的分解，产生的NH3使培养基的pH由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红变成红色，菌落的周

2、围会产生红色环带，红色环带愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。三.实验步骤２.倒平板３.制备一定浓度梯度的细菌悬液１g土壤＋９９ml无菌水，振荡，为１０-2稀释液，依次制备１０-3、１０-4、１０-5的土壤稀释液。４.稀释涂布分离法分离细菌１.制备无菌的全营养ＬＢ固体培养基和尿素固体培养基５.培养观察（倒置，37℃24-48h）（无菌，0.1ml，玻璃刮刀）1、配制培养基尿素培养基葡萄糖0.025gNaCl0.12gK2HPO40.12g琼脂糖0.5g酚红0.25g尿素10mlLB培养基蛋白胨：0.25

3、g酵母提取液：0.12gNaCl：0.25g琼脂糖：0.5g对照组选择培养基实验组为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？琼脂和琼脂糖琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖和琼脂果胶，还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是：①其主要成分不能被微生物利用；②可使培养基固化；③不影响培养基中其他营养物质被细菌吸收。实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮

4、化合物被以非尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。思考？选择培养基加入青霉素的培养基:分离酵母菌、霉菌等真菌加入高浓度食盐的培养基:分离金黄色葡萄球菌不加氮源的无氮培养基:分离固氮菌不加含碳有机物的无碳培养基:分离自养型微生物加入青霉素等抗生素的培养基:分离导入了目的基因的受体细胞——添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离2、倒平板制备空白平板：取2个三角瓶，分别装入已灭菌的全营养LB固体培养基和尿素固体培养基，放在超净工作台上，冷却至60℃左右时，在酒精灯旁把上述两种培养基分别倒至培养皿中，轻轻

5、摇匀，平放至凝固。2、倒平板在无菌条件下，在将1g土样加到装有99mL无菌水的三角瓶中，振荡10min，即成10-2土壤稀释液，并依次制备出10-3～10-5稀释液。例如，若想制备10-3的稀释液，可取0.5mL10-2的稀释液。取样时，尽量只取悬液，倒入有4.5mL无菌水的有盖试管中，摇匀，放在试管架上。3、制备细菌悬液4、涂布分离涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取0.1mL的稀释度为10-3、10-4和10-5的土壤稀释液（细菌悬液），分别加到装有全营养LB培养基和尿素培养基的培养皿（空白平板）中

6、；再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。接种取0.1ml菌悬液涂布分离按浓度捆成一摞5、37℃恒温培养箱倒置培养四1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂思考题：2

7、、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下就会被水解，水解后的NH3会使土壤变成碱性，NH3与其他阴离子物质如SO42－、CO32－、NO3－等形成化合物，则会使土壤板结。有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用

8、，从而证明这一菌株以尿素为氮源。4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落因为全营养培养基中的氮源是蛋白胨，很多细菌都能利用它，而尿素培养基中的氮源只有尿素，只有含脲酶的细菌才能利用尿素，能存活。这一现象表明能利用尿素的细菌在土壤菌群中只占有极少数量。