高效液相出现双峰原因

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1、HPLC分析中，在色谱柱正常，样品灵敏度足够，分析方法合适，色谱峰在出峰时间较短的条件下（不包括梯度），峰型应对称而尖锐。但是，在对样品了解程度不够，方法不妥，样品处理方法及进样方式不合理下，会出现各种意想不到的问题，而对色谱峰难以作出合理的解释，尤其对于新手更是如此。下面根据本人几年工作的体会，提出一些看法，向同仁指教。色谱双峰指的是明是一种物质，但在色谱图中出现双峰，而表明含二种物质。我将这种情况分为四种原因。1色谱柱如果你分析样品时发现每个色谱峰都双峰出现（出峰越快，双峰的可能性会减少），尤其采用单一纯物质时，可以肯定色谱柱出问题－柱头受损或柱头固定相变脏或流失。如果进样量少，原来

2、色谱柱正常，色谱峰的形状多为一大峰带一小峰，不一定拖尾，这一般应是柱头受堵，将色谱柱反过来接，用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂，将堵在柱头的残留物冲掉，再反过来，一般情况下就行了。当然不反冲，正冲有时也会正常的。如果峰拖尾，双峰强弱相差不大，柱头固定相变脏或流失可能性更大，这是可以将进样那头拧开，将微孔滤片超声，柱头刮去一部分填料，重新填上新填料拧紧，不过这种活，需要一定技术，同时不能老干那种事，否则用不了几次，色谱柱就会应柱效很低而报废。2溶剂极性及进样量许多HPLC分析者对此可能不以为然，一般的HPLC的书籍和文献都不会提到这方面的内容，而这确是双峰产生的一个很重要的原因。目前HPLC分

3、析多为反相色谱，流动相多为甲醇、乙腈、水，加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解。最佳的溶解方法是用流动相溶解，但是很多情况是不一致的。当用溶剂极性强度大的试剂，如纯甲醇、纯乙腈，纯乙醇，而分析体系中以水为主，样品进样量大，如定量管为20ul，此条件下完全可以肯定，单一的纯物质出双峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一样），且拖尾，保留时间会提前(相对进样量少而言)，将进样量减少一半以上，峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大，而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的。上面提到进样量造成双峰的一个原因，另一个原因是，进样量不一定大，但绝对量很大，色谱图上的双峰紧

4、靠在一起，基本上齐高，不拖尾（如果出峰很快，也可能是色谱柱问题）。将样品稀释再进样就可以了，这是由于进样量过大，色谱柱过载造成的。3样品的特性有些样品由于其化学结构的特点，存在互变异构现象，而这种互变异构体无法分开，而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时，在一个特定的条件下，一种物质将出现双峰，双峰靠的很近，基本齐高，不拖尾，条件稍一变化，尤其pH，双峰现象将消失，如红霉素等。有的样品紫外的色谱图上看不到双峰，但在LC－MS下，用质谱检测器，其质谱的总离子流图上较明显，例如我分析过的农药啶虫眯（吡虫清）。4参数记录的参数一般都内定的，不必修改，但GC和HPLC的参数是不完全一致的，例如C－

5、R3A数据记录仪上的一般记录时间间隔GC为2ms，HPLC为5ms，如果记录间隔时间缩短，一个峰将变为二个峰或更多。高效液相反相梯度色谱中出现鬼峰的原因   鬼峰产生的原因是多种多样的，现将原因归纳为以下几个方面：   1、流动相、样品稀释液、仪器或是容器中存在杂质，当梯度开始时由于有机相比例不高，洗脱能力不强，杂质在色谱柱柱头富集，随着流动相比例变化，洗脱能力增强，富集的杂质被洗脱，从而形成鬼峰。2、流动相脱气不完全。空气在有机相和水中的溶解度不同，当水和有机相混合时，气泡就产生了。3、操作问题原因1主要有以下几种情况1、试剂问题a)有机溶剂甲醇制备工艺相对乙腈来说较为简单，杂质含量也

6、较少。但是由于甲醇紫外吸收范围比乙腈广，所以当使用紫外检测器时，尤其是波长较低时，尽量使用乙腈作为有机相，用甲醇的话漂移太大。而用作梯度色谱的乙腈质量要求较高，一般用进口梯度色谱专用乙腈能够很好的减少鬼峰的出现。b)水很多单位用自制蒸馏水作为水相，但是结果并不是很好。原因就是一些低沸点的有机杂质并不能够通过蒸馏除掉。有条件的尽量用HPLC级的纯水，没有条件的也可用娃哈哈或是屈臣氏等水代替，但是如果色谱条件比较严格也是有可能出问题的。c)其它试剂缓冲盐、TFA、EDTA等试剂也会对流动相造成很大的影响，尽量用纯度高的试剂配制流动相。2、仪器问题a)液相的流动相管路被污染。长时间的使用含水量

7、较高的流动相（尤其是加入缓冲盐的），细菌就容易在管路中滋生，细菌的代谢产物或是细胞碎片能造成鬼峰。b)输送泵故障，造成系统压力不稳，从而产生鬼峰。c)单向阀堵塞，造成系统压力不稳，从而产生鬼峰。早期岛津的液相单向阀貌似不能用纯乙腈作为流动相，现在应该已经得到改进。原因2主要有以下几种情况1、在线脱气机脱气不完全。2、两种流动相的有机相比例相差太大。例如A为100%^水，B为100%^乙腈。在梯度条件允许的情况下尽量减少两中流动相之间