胚胎先天性神经管缺陷的表达差异基因

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1、胚胎先天性神经管缺陷的表达差异基因【】目的：研究妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷的分子机制.方法：将29只sd雌性大鼠分为3组：①正常对照组，8只；②实验模型组，链脲佐菌素(stz)构建的妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷，12只；③实验对照组，stz构建的糖尿病大鼠模型但胚胎不伴有先天性神经管缺陷发生，9只.于妊娠第12日取出各组胚胎，解剖显微镜下进行形态学分析.提取卵黄囊细胞mrna，用cdna基因芯片技术对表达差异基因进行检测.提取卵黄囊细胞蛋白质，应用特异性抗磷酸化抗体进行免疫共沉淀及apkinase信号途径上各蛋白激酶活性进行分析.结果：提取实验模型组大鼠胚胎卵黄

2、囊细胞mrna，与正常对照组大鼠胚胎卵黄囊细胞mrna共1200个基因同时进行比较，共筛选出表达差异基因79条，其中42条表达上调基因，包括凋亡相关基因bax，bcl2，heatshock70，glucosetransporter3等；37条表达下调基因包括phospholipasea2，insulinlikegroapkinase及细胞凋亡信号传导机制参与密切相关.【关键词】cdna；基因芯片；神经管缺陷；糖尿病；mapkinase；细胞凋亡0引言妊娠合并糖尿病孕妇的胎儿(infantsofdiabeticmothers，idm)重要器官先天性畸形的发生率高达6％～10％，并

3、直接导致50％的围产儿死亡率.其中，高血糖内环境引起的胚胎先天性神经管缺陷的复杂病因，包括脂质、蛋白质代谢失调及超氧阴离子自由基的作用，引起胚胎卵黄囊细胞膜基本脂质成分缺失等原发性损伤［1］，表现出细胞信号传导的变化.我们应用cdna基因芯片技术［2］，对大鼠胚胎卵黄囊细胞1200个基因表达差异基因mrna进行检测，旨在筛选参与先天性神经管缺陷发生的表达差异基因，并在此基础上深入揭示参与其发生的信号传导机制.1材料和方法1.1材料雌性sd大鼠29只，鼠龄70～90d，体质量250～300g（第四军医大学实验动物中心），与同种系的sd雄性大鼠交配后常规培养于动物中心.链脲佐菌素(str

4、eptozotocin,stz)(美国sigma公司)；总rna标记和纯化试剂盒(clontech,#k1038)；cdna探针(altlastmcdnaexpressionarrays,clontech,#pt31401).1.2方法1.2.1动物模型的建立将sd雌性大鼠与同种系无糖尿病的雄性大鼠交配，次日清晨阴道涂片发现精子的确定为受孕0d.将雌性大鼠分为正常对照组（n=8），常规饲养.实验模型组（n=12），由stz构建的妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷，即于受孕第6日尾静脉注射65mg/kgstz.实验对照组（n=9），由stz构建的糖尿病大鼠模型但胚胎不伴有先天性神

5、经管缺陷发生，每日采尾静脉血250mg/d测血糖，符合妊娠合并糖尿病标准，否则从实验组中排除.于受孕第12日从各组中取出胚胎.1.2.2动物分组将29只sd雄性大鼠分为3组：①正常对照组，8只；②实验模型组（stz构建的妊娠合并糖尿病诱发胚胎先天性神经管缺陷），12只；③实验对照组（stz构建的糖尿病大鼠模型但胚胎不伴有先天性神经管缺陷发生），9只.1.2.3总rna提取及cdna探针合成、标记应用总rna标记和纯化试剂盒提取并纯化各组卵黄囊细胞中总rna.应用超声匀浆机在0℃充分粉碎卵黄囊细胞，匀浆组织经酚/氯仿抽提，异丙醇沉淀rna，800ml/l乙醇洗涤rna，空气干燥rna沉

6、淀.37℃经dnasei处理的无rnaseh2o溶解rna，沉淀30min，纯化从卵黄囊细胞中提取总rna，电泳检测rna产量并储存-80℃备用.以纯化的5μg总rna为模板，cds混合引物合成cdna探针（altlastmcdnaexpressionarrays,clontech,#pt31401)，经反转录酶和［α32p］datp于50℃标记探针25min.经提取、纯化试剂盒洗脱未标记的探针，测量标记cdna探针的放射性同位素的量.1.2.4核酸杂交和cdnaarrays分析atlastm大鼠1.2array(clontech,#78541)尼龙杂交膜，包括1200个基因的

7、cdna杂交点，9个看家基因作为阳性对照.探针于68℃预杂交30min，应用杂交液和鲑精dna在尼龙膜上68℃杂交过夜，严格洗涤膜，-80℃kodarkxray胶片压片3~7d.扫描杂交信号后经atlasimage1.01软件(clontech)分析结果.1.2.5蛋白激酶磷酸化分析匀浆并提取各组胚胎卵黄囊细胞蛋白质，蛋白电泳装置(biorad)将20μg蛋白进行100g/lsdspage，15～20ma电泳2h，将蛋白转印装置在含200g/l甲醇的