基于phi29 dna聚合酶和cre重组酶的环状dna分子等温扩增

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1、基于Phi29DNA聚合酶和Cre重组酶的环状DNA分子等温扩增IsothermalamplificationofcircularDNAmoleculesbasedonPhi29DNApolymeraseandCrerecombinase工程领域：制药工程作者姓名：李生指导教师：齐浩教授企业导师：于祥春副高级工程师天津大学化工学二零一七年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材

2、料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日2摘要等温扩增是在恒定温度下对核酸分子进行扩增，相比PCR等传统的体外扩增方式，其对设备的

3、要求低、低能耗、反应时间短、更能满足简单操作的需求，而广泛应用于临床诊断、即时诊断、全基因组扩增、单核苷酸多态性分析等领域。在当前主要的等温扩增方法中，滚环扩增（Rollingcircleamplification，RCA）由于操作简单，扩增速度快，而备受关注。本文利用RCA和位点特异性重组研究在体外扩增环状DNA分子，不同于传统等温扩增的线性产物，其产物为环状分子，对完善现有等温扩增体系具有重要的意义。在制备反应所需酶的过程中，摸索了Phi29DNA聚合酶、归巢内切酶I-HmuI、Cre重组酶等蛋白的表达条件，发现诱导温度和IPTG浓度会显著影响蛋白的表达情况

4、，降低温度和IPTG浓度会增加蛋白的可溶性表达。以此为基础，通过大量的实验确定了Phi29DNA聚合酶、I-HmuI、Cre重组酶等13种蛋白的适宜表达条件。依照适宜的表达条件扩大培养，最终纯化了Phi29DNA聚合酶等12种蛋白。在蛋白纯化过程中，基于小分子泛素样修饰蛋白（SUMO）融合标签技术，我们进一步优化了天然N末端蛋白纯化方法，并用该方法制备了Phi29DNA聚合酶及其变体（T15I，N62D）、Cre重组酶。使用光吸收法测定了蛋白的浓度，通过蛋白凝胶电泳（SDS-PAGE）分析了蛋白的纯度。随后分别对Phi29DNA聚合酶、I-HmuI、Cre重组酶

5、的活性进行了分析，并对其最佳反应条件进行了优化。然后以质粒DNA为底物，进行Phi29DNA聚合酶、I-HmuI耦合的体外扩增反应，确定了Phi29DNA聚合酶利用I-HmuI产生的单链DNA切口进行等温扩增的最佳反应条件。最后，在上述实验结果的基础上，我们尝试了对I-HmuI催化的单链切口反应、Phi29DNA聚合酶催化的滚环扩增反应、Cre重组酶催化的位点特异性重组等三个反应的耦合，研究了一步法从环状DNA模板到环状DNA产物的等温扩增技术。关键词：RCA，Phi29DNA聚合酶，位点特异性重组，Cre重组酶，体外扩增IABSTRACTIsothermala

6、mplificationisaprocessinwhichnucleicacidmoleculeswereamplifiedataconstanttemperatureinvitro,comparedwiththetraditionalPCRamplificationmethod,therequirementforequipmentislow,lowenergyconsumption,shortreactiontime,canmeetthedemandofrapidandsimple,thuswidelyusedinthefieldofclinicaldiagn

7、osis,point-of-care(POC),wholegenomeamplification,singlenucleotidepolymorphismanalysis,etc.Amongthecurrentmajorisothermalamplificationmethods,Rollingcircleamplification(RCA)hasattractedmuchattentionbecauseofitssimplicityandrapidamplification.Inthispaper,wecoupledRCAwithsite-specificre

8、combinationt