微流控芯片与激光拉曼光镊系统联用技术的研究

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1、悬浮液中的样品，这种光学固定技术没有任何机械接触，不会引起细胞表面效应，也不需要添加任何化学药剂进行固定，使得活细胞可进行长时间的拉曼光谱探测。既克服了传统拉曼光谱探测中固定技术的缺陷，也提高了生物单细胞在实验过程中的活性。近年来，国际上对拉曼镊子展开了广泛研究，如美国EastCarolina大学、加州大学、美国陆 军实验室、西班牙ICFO等，拉曼镊子作为一种不断发展的新实用技术备受关注。拉曼镊子是一项新的光学技术，最明显的特点是结合了光镊与显微拉曼光谱技术，能完成对样品以前不能达到的控制且具有高分辩能力。单束激光经过带有高数值孔径的倒置显微物镜进行聚焦，形

2、成的光阱即为光镊[18]。光阱将单个微小样品束缚在激光焦点附近的平衡位点上，实现对样品的三维俘获，同时激光激发样品的拉曼光谱信号，并通过倒置显微镜耦合光谱仪进行光谱收集（图1-1）[19]。图1-1实验装置图：一束二极管激光穿过干涉滤波片、针孔、二向色镜，然后被引入到倒置显微镜中形成光阱。被囚禁的微粒的拉曼光通过同一显微物镜之后，穿过陷波滤波片和针孔，然后聚焦到耦合CCD的光谱仪的入口处进行收集。TC，激光器温度控制器； DL，二极管激光器；IF，干涉滤波片；M，反射镜；L，棱镜；PH，针孔；HNF1和HNF2， 陷波滤波片；CCD，电子耦合器件；DM，二向

3、色镜；BS，分光镜；Obj，显微物镜；2EP，目镜；VC，摄像机；Lamp，过滤绿光的氙灯[19]两种技术的结合使得拉曼镊子兼具拉曼光谱和光镊的特点。生物细胞包含细胞膜及其膜内大生物分子的复杂混合物。这些生物分子包括核酸、蛋白质、多糖和脂类[13]。它们的组成成分、二级结构和交互作用等有用信息都可以从光谱中拉曼特征峰的位置、强度和线宽中获得[17]。拉曼光谱能使拉曼镊子更多地提供生物细胞的识别、组成成分和结构形状的信息。光镊也能使拉曼镊子很容易分开细胞或生物大分子进行单独地研究，如对不同条件或处理的混合溶液中的细胞。拉曼镊子还具有提高拉曼光谱信噪比的优点，如

4、消除杂散光和荧光，在光阱的适当位置俘获分子，在最佳状态下激发和收集拉曼光谱[11]。1.2拉曼光谱[20-22]当平行光投射于气体、液体或透明晶体的样品上，大部分沿原来的方向透射而过，小部分则以不同的角度散射开来，这种现象称为光的散射。散射是光子与物质分子相互碰撞的结果[20]。单色光束的入射光（IncidentLight）光子与分子相互作用时可发生弹性 碰撞和非弹性碰撞（见图1-2），在弹性碰撞过程中，光子与分子间没有能量交换，光 子只改变运动方向而不改变频率，这种散射称为Rayleigh散射。而在非弹性碰撞过程中，光子与分子之间发生能量交换，光子不仅仅改

5、变运动方向，同时光子的一部分能量传递给分子，或者分子的振动和转动能量传递给光子，从而改变了光子的频率，这种散射称为Raman散射[21]。Raman散射效应是印度物理学家C.V.Raman在1928年首先发现并以他的名字命名的。图1-2反斯托克斯散射、瑞利散射和斯托克斯散射三种光散射图拉曼散射是由光子的非弹性碰撞产生的。这种散射过程不包括能级间的直接跃迁（吸收或辐射），而是一种与中间虚态（virtualstate）有关的过程。以双原子分子为例， 拉曼散射过程的能级示于图1-3。E1、E2分别表示振动的基态与激发态，假定作用到样品3上的激光频率为ν，相应的光子

6、能量为hν0。当分子从振动基态E1（或振动激发态E2）0被入射光激发到能级为E+hν或（E2+hν0）的虚态，然后又回到振动态E1（或振动激10发态E2），这种现象称为Rayleigh散射。另一种散射过程是非弹性的，即散射光的光子 能量与入射光不同。这种过程可能有两种不同的结果：一种是处于振动基态E1的分子，被入射光hν激发到虚态E1+hν0，然后回到振动激发态E2，产生能量为h(ν0−ν)的拉曼0散射，称之为斯托克斯散射(StokesRamanScattering)；另一种是处在振动激发态E2的分子被入射光hν激发到虚态E2+hν0，然后回到基态E1，产生

7、能力为h(ν0+ν)的拉曼散射，0称之为反斯托克斯散射(Anti-stokesRamanScattering)。波耳兹曼定律认为，在一定温度下，处于基态的分子数比处于激发态的分子数多。故一般情况下大部分分子处于基态，所以，斯托克斯线的强度比反斯托克斯线的强度大，通常的拉曼光谱实验检测得到的是斯托克斯线[22]。Rayleigh散射强度约为入射光强度的 10-5，而拉曼谱线的强度约为Rayleigh散射强度的10-2，所以拉曼光谱较难观测。随着激光技术的发展，有了很高强度的单色光源，为拉曼光谱的应用创造了有利条件。图1-3拉曼散射效应能级图拉曼光谱属于分子振动

8、光谱，拉曼谱线的数目、位移值的大小和特征峰的强度等都