pcr扩增常见问题及特点

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1、PCR扩增常见问题及特点PCR产物的电泳检测时间一般为48h以闪，有些最好于当R电泳检测，大于48h后带型不规则甚至消失。假阴性，不出现扩增条带。PCR反应的太键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。校板.•①模板屮含有杂俎0质，②模板屮含奋Taq酶抑制剂，③模板屮缶白质没奋消化除净，特别足染色体屮的组蛋Q，④在提取制备模板吋丢失过多，或吸入酚。⑤榄板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩蹭带，极冇可能是标木的消化处理，模板核酸捉取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固

2、定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧W种酶M时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够Ifij导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或浪乙锭。引物.•引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、界易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看0D值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要冇引物条带出现，而且两引物带的亮度应人体-致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，J、V和引物合成单位协商解决。如一条引

3、物亮度商，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物成高浓度小景分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，异致引物变质降解失效。④引物&计不合理，如41物长度不够，物之间形成二聚体等。Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很人，浓度过岛可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产景其至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采川的体积为20ul、30uh50uh或100ul，应川多大体积进行PCR扩增，是根裾科研和临床检测不同R的Kij设定，在做小体积如20ul再做大体积吋，一定要模索条件，否则容易失败。物理原W:变性对PC

4、R扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时闽短，极存可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合Ifij降低PCR扩增效率。有吋还有必耍用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸溫度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时K条带更整齐，亮度更商。引物设计不合适：选择的扩垴序列与非R的扩垴序列有同源性，因而在进行PCR扩垴时，扩增出的pc

5、r产物为非n的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染:这种污染有两种原因：一足整个基因组或人片段的交义污染，导致假阳性。这种假阳性可川以卜'方法解决：操作吋应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所侖试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标木前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而异致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除

6、。出现非特异性扩增带PCR扩增后!li现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异忡扩増带。非特异性条带的出现，艽原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离了浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多冇关。其次是酶的质和景，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶景过多有时也会出现非特异性扩增。对策有：必要时重新设汁引物。减低酶W:或调换另一来源的酶。降低引物S，适当增加模板显，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法（93°C变性，65°C左右退火勾延仲）。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出

7、现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往III于酶鲎过多或酶的质M差，dNTP浓度过高,Mg2+浓度过商，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策奋:减少酶量，或调换另一來源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板呈，减少循环次数。（1）PCR产物是否耑要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物以有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了人景引物的二聚体。少暈的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带奋引物二聚体的克隆，而非0的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。（2）如果没有回收到目的片段，