DB 37T 3104—2018 向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准

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1、ICS 67.060B21     DB37山东省地方标准DB37/T3104—2018     向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准ThevarietypurityidentificationtechniqueofsunflowerseedswithSSR2018-02-02发布2018-03-02实施山东省质量技术监督局   发布DB37/T3104—2018前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由山东省农业厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准主要起

2、草单位:山东农业大学、北京德农种业有限公司。本标准起草人：张春庆、赵洪春、郑建鹏、温大兴、李岩。本标准为首次发布。10DB37/T3104—2018向日葵杂交种品种纯度SSR分子检测标准1　范围本规程规定了SSR分子检测向日葵种子纯度的试剂配比、DNA提取、SSR引物选择、多重PCR方法、PCR产物检测等技术要求。本规程适用于向日葵品种和杂交种种子纯度的室内快速鉴定。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其

3、最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB3543种子检验技术规程GB20464农作物种子标签通则3　术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1　杂交种各种直接用于生产的杂交向日葵一代种子。3.2　品种纯度品种在特征特性方面典型一致的程度，用本品种的种子数占供检本作物样品种子数的百分率表示。3.3　标准样品能够充分代表种或品种特征特性的种子样品，或具备指定特征、特性样品。3.4　引物一条互补结合在模板DNA链上的短单链，能提供3’-OH末端作为DNA合成的起始点，延伸合成模板DNA的互补链。4

4、　原理10DB37/T3104—2018从向日葵种子中提取DNA，利用SSR引物进行PCR扩增，不同碱基长度的PCR扩增引物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并通过染色显示DNA指纹谱带类型。不同向日葵品种由于遗传组成不同，基因组中DNA简单重复序列的重复次数有差异，这种差异可通过PCR扩增、电泳、染色程序获得的DNA指纹图谱加以区分，从而对不同品种进行鉴定。杂交种纯度鉴定时，可从附表中选取亲本有差异的SSR引物。品种纯度鉴定时，从附表中选择生产上常用品种间有差异的引物。1　仪器与试剂1.1　仪器电子天平

5、，水平摇床，双垂直板电泳槽，PCR仪，电泳仪，高压灭菌锅，观片灯。1.2　试剂丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、谷氨酸、乙二胺四乙酸二钠、硼酸、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、氢氧化钠、氢氧化钾、甲醛、2×PowerTaqPCRMasterMix、超纯水、SSR引物、硝酸银（所用试剂均为分析纯，所用水均为去离子水)。2　溶液2.1　提取液称取0.56g氢氧化钾于100mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100mL，4℃贮存备用。2.2　30%凝胶溶液称取292g丙烯酰胺于1000mL烧杯中，加去离子水溶

6、解，再加入8g甲叉双丙烯酰胺，溶解后定容至1000mL，4℃贮存备用。2.3　5×TBE称取54gTris、3.72g乙二胺四乙酸二钠、27.5g硼酸于1000mL烧杯中，溶解后定容至1000mL。2.4　催化剂称取10g过硫酸胺于100mL烧杯中，加去离子水溶解并定容至100mL，4℃贮存备用。2.5　电极缓冲液取5×TBE200mL，用去离子水定容至1000mL。2.6　染色液称取1g硝酸银溶于500mL去离子水中。2.7　显色液称取10g氢氧化钠溶于500mL去离子水中，用时加2mL甲醛。3　

7、操作程序10DB37/T3104—20181.1　DNA提取从送验样品中随机数取向日葵种子200粒，将种子剥壳后纵切，放入1.5mL离心管中，加入300μL提取液，提取时间1min～24h均可，使用前混匀、静止5分钟、离心3000rpm，0.5min，取上清即为DNA样品，用于PCR扩增时DNA样品模板量为2μL。1.2　扩增体系采用20μL扩增体系，其中每对U-primers的上下游引物(10μM)各0.5μL，2μL25mmol/LMgCl2，0.2μL5U/μLTaq酶，2μL10×PCRBu

8、ffer，2μLDNA提取液，用灭菌后的超纯水补足20μL。1.3　多重PCR扩增程序通用多重PCR扩增程序采用“两段循环模式”：a)预变性(94℃，5min)；b)第一段循环(循环数：3)命名为“逐一退火循环”：变性(94℃，40s)；按照未加通用接头前的多对引物的退火温度从高到低的顺序逐一退火，每个退火温度的退火时间为20s；延伸(72℃，30s)；c)第二段循环(循环数：28～32，通常为30个循环)：变性(94℃，40s)；将退火和延伸过程合并(70℃，50s