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时间:2018-10-07
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1、第七章细胞培养的污染及控制污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。一开始就要十分重视,应积极采取措施,防止污染,否则会前功尽弃,不仅浪费时间,而且浪费人力、物力,甚至造成无法弥补的损失。第一节 污染的类型及鉴别细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物,而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质,包括生物和化学物质。一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染,即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量),也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌,如枯草杆
2、菌,以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌,其中又以白色葡萄球菌较常见。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用,其繁殖处于抑制状态,细胞生长不受明显影响.一、细菌污染培养细胞受细菌污染后,会出现培养液变混浊,pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变,只能在镜下发现菌体才知污染。所以,每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变,胞内颗粒增多、增粗,最后变圆脱落死亡,造成试验失败和细胞株(系)丢失。被洋葱佰克霍尔德菌污染(假单胞菌属,是植物病原菌,因引起洋葱患病而得名)二、真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种,尤在霉雨季节进
3、行细胞培养更易污染。最常见的真菌:烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌。培养细胞受真菌污染后,可见培养液中漂浮着白色或浅黄色小点,培养液一般不发生混浊;倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中,有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。镜下看时,要将培养瓶用酒精棉擦干净,以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后,细胞生长变慢,最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。污染的鉴别细菌、真菌污染的检测:肉眼直接观察法、培养检查法和显微镜观察法1.肉眼观
4、察细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生,而且增生迅速,若有污染,在48hr内可明显观察到。如培养液变混浊,或略加振荡有很多漂浮物漂起。2.显微镜下观察细菌污染大多数可以使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察,可见满视野都是点状的细菌颗粒,原来的清晰培养背景变得模糊,大量的细菌甚至可以覆盖细胞,对细胞的生存构成威胁。在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮,即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。3.培养检察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种,
5、也可发现是否有污染。怀疑培养细胞有细菌污染时,取10ml细胞悬液离心1000转5分钟,沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养,24小时内可以获得结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时,大约每20分钟一代,会使培养系统中很快产生大量细菌,后者不仅可以消耗培养系统中的养分,还能释放大量代谢产物。几个小时后,增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊,肉眼就可以判断。白色念珠菌污染三、支原体污染及检察造成支原体高污染率的原因:1.支原体大小0.1-0.8um,无细胞壁,可透过一般过滤膜(0.22-0.4
6、5um);2.支原体污染时,没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化;开始不易发现,能在偏碱条件(pH7.6~8.0)下生存,对青霉素有抗药性,多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式;4.细胞流通间缺乏物品管理,造成实验室间的相互污染;5.研究或操作人员忽略污染问题;6.已受污染的细胞;7.已受污染的培养基、血清。三、支原体污染培养细胞受支原体污染后,部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢,部分细胞变圆,从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化,或略有变化,若不及时处理,还会产生
7、交叉污染。支原体污染的检测1.相差显微镜观察将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片),24小时后用清洁镊子从培养瓶中取出支持物,细胞面向上放置于载物片上,再盖上较大盖玻片,用相差油镜观察;若不用支持物培养法,直接取少许培养液滴在载物片上,再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒,多位于细胞与细胞之间,有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。2.低涨处理地衣红染色观察取样:(1)取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液,用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞
8、。固定:(2)用新配制的Carnoy液固定两次,每次10分钟,取出盖片凉干。(3)用培养液时,先吸取1mL,500~800r/min离心5分钟后去除上清,留0.2mL,将0.5%枸椽酸溶液加入其中,置10分钟,加入Carnoy液固定。2.低涨处理地衣红染色观察(4)离心弃上清固定液,余0.2mL沉淀物,制成2~3张涂片。染色:(5)然后用2%醋酸地衣红(地衣红2g,冰醋酸
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