第7章 细胞培养的污染及控制

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1、第七章细胞培养的污染及控制污染是细胞培养的大敌。预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。一开始就要十分重视，应积极采取措施，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。第一节　污染的类型及鉴别细胞培养过程中的污染不仅仅指微生物，而且还包括所有混入培养环境中的、对细胞生存有害或造成细胞不纯的物质，包括生物和化学物质。一、细菌污染细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆

2、菌，以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。细菌污染初期由于培养体系的抗生素作用，其繁殖处于抑制状态，细胞生长不受明显影响.一、细菌污染培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。被洋葱佰克霍尔德菌污染（假单胞菌属，是植物病原菌，因引起洋葱患病而得名）二、真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤在霉雨季节进

3、行细胞培养更易污染。最常见的真菌：烟曲霉、黑曲菌、毛霉菌、白色念珠菌、酵母菌。培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色小点，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。污染的鉴别细菌、真菌污染的检测：肉眼直接观察法、培养检查法和显微镜观察法1．肉眼观

4、察细菌、真菌污染常在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且增生迅速，若有污染，在48hr内可明显观察到。如培养液变混浊，或略加振荡有很多漂浮物漂起。2．显微镜下观察细菌污染大多数可以使培养液变浑浊、变色。用相差显微镜观察，可见满视野都是点状的细菌颗粒，原来的清晰培养背景变得模糊，大量的细菌甚至可以覆盖细胞，对细胞的生存构成威胁。在倒置显微镜的高倍镜下可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮，即为细菌污染。若细胞之间有丝状、管状、树枝状或卵形的物质常为真菌污染。3．培养检察采用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，

5、也可发现是否有污染。怀疑培养细胞有细菌污染时，取10ml细胞悬液离心1000转5分钟，沉淀中加入无抗生素培养液2ml,将细胞放培养箱培养，24小时内可以获得结果。当污染的细菌量比较大或者细菌增殖到一定基数时，大约每20分钟一代，会使培养系统中很快产生大量细菌，后者不仅可以消耗培养系统中的养分，还能释放大量代谢产物。几个小时后，增殖的细菌就可以导致培养液外观浑浊，肉眼就可以判断。白色念珠菌污染三、支原体污染及检察造成支原体高污染率的原因：1.支原体大小0.1－0.8um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.4

6、5um）；2.支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化；开始不易发现，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素有抗药性，多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。3.过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式；4.细胞流通间缺乏物品管理，造成实验室间的相互污染；5.研究或操作人员忽略污染问题；6.已受污染的细胞；7.已受污染的培养基、血清。三、支原体污染培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生

7、交叉污染。支原体污染的检测1．相差显微镜观察将细胞接种于事先放置于培养瓶内的支持物(一般用长形盖玻片)，24小时后用清洁镊子从培养瓶中取出支持物，细胞面向上放置于载物片上，再盖上较大盖玻片，用相差油镜观察；若不用支持物培养法，直接取少许培养液滴在载物片上，再盖上盖片观察亦可。支原体在镜下呈暗色微小颗粒，多位于细胞与细胞之间，有时可见类似于布朗运动的表现。应注意与细胞破碎溢出的内容物如线粒体等相区别。2．低涨处理地衣红染色观察取样：（1）取已在培养瓶中的支持物盖片或培养液，用新鲜配制的0.5%枸椽酸溶液处理盖片细胞

8、。固定：（2）用新配制的Carnoy液固定两次，每次10分钟，取出盖片凉干。（3）用培养液时，先吸取1mL，500～800r/min离心5分钟后去除上清，留0.2mL，将0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分钟，加入Carnoy液固定。2．低涨处理地衣红染色观察（4）离心弃上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成2～3张涂片。染色：（5）然后用2%醋酸地衣红(地衣红2g，冰醋酸