细胞生物学实验-细胞融合

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1、细胞融合实验liuzhe5@163.com概念促融合剂与融合技术应用与意义重点一定义：Cellfusion细胞融合：(Cellfusion)又称体细胞杂交（somatichybridization）是指将不同来源的原生质体(除去细胞壁的细胞)相融合，将两个或多个细胞合并成一个细胞的技术。人心肌细胞人肝脏细胞种内杂交细胞人细胞鼠细胞种间杂交细胞在适当的条件下，细胞融合在一起，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。种内杂交细胞（intraspecifichybridc

2、ell）:同种细胞融合而成的细胞种间杂交细胞（interspecifichybridcell）:不同种的细胞融合而成的细胞非对称细胞融合（asymmetricfusion）：利用物理或化学方法使某亲本细胞的核或细胞质失活后再进行融合。细胞核或细胞质失活的有物理和化学方法：1.物理方法，如X射线、r射线等，它们能使细胞核失活；2.化学方法，核失活－碘乙酰胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；质失活－罗丹明（R－6－G，它是一种亲脂染料，能够抑制线粒体的氧化磷酸化过程而达到失活作用。动物克隆上海第二

3、医科大学陈莹博士2003年，她将一5岁男孩的包皮细胞与一只已去除细胞核的新西兰兔卵母细胞融合，获得了人类早期胚胎。二细胞融合的原理荧光标记的小鼠细胞和人细胞融合实验将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素(fluorescin)结合,人的抗体与发红色荧光的罗丹明(rhodamine)结合；显微镜下的细胞融合过程细胞融合的过程细胞互相靠近细胞膜融合细胞桥形成细胞质融合细胞核融合细胞融合主要经过了两原生质体或细胞互相靠近、细胞桥形成、胞质渗透、细胞核融合主要步骤。细胞桥的形成是细胞融合最关键的一步，融合过程中两个细胞

4、膜从彼此接触到破裂形成细胞桥。细胞融合过程中两个细胞膜的变化形成细胞桥的具体变化细胞融合分为两种：1.自发细胞融合2.人工诱导细胞融合（1）自发细胞融合自发细胞融合（spontaneouscellfusion）是在未施加任何诱导条件的情况下所发生的细胞融合现象。自发细胞融合现象在自然界中并不多见，常见的主要有以下几种情况：1.精子和卵子受精2.肌管的形成3.胚胎着床4.巨细胞的形成5.破骨细胞的形成6.肿瘤细胞融合（2）诱导细胞融合人工诱导细胞融合是在人为条件下发生的细胞融合现象常用的诱导方法有三种：1.

5、生物法（病毒诱导法等）2.化学法（PEG诱导法、Ca2+诱导法、溶血卵磷脂诱导法等）3.物理法（电诱导法等）1.病毒诱导法常用的病毒：仙台病毒（Sendalvirus),又称日本血凝病毒（HemagglutinatingvirusofJapan,HVJ）属于副粘液病毒科，RNA病毒，圆球形1962年，日本仙台东北大学学者冈田发现仙台病毒可诱导细胞融合。病毒促使细胞融合两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透--------细胞核互相融合，进入正常的细胞分裂途径，杂种子细胞。

6、2化学法（聚乙二醇）PEG:聚乙二醇（polyethyleneglycol,PEG）分子式：HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH性状：白色蜡状固体，具有强烈的凝集、沉淀蛋白质的作用分子量〉1000-6000u，可作诱融剂。20世纪70年代，华裔科学家高国南发现聚乙二醇能诱导细胞融合分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。pH偏碱时融合效应最高。用作细胞融合剂的聚乙二醇一般选用分子量为4000者，常用浓度为50％，pH8.0~pH8.2聚乙二醇普遍认为聚乙二醇分子能改变

7、各类细胞的膜结构，使两细胞接触点处质膜的脂类分子发生疏散和重组，由于两细胞接口处双分子层质膜的相互亲和以及彼此的表面张力作用，从而使细胞发生融合基本原理聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物，商品名卡波蜡(Carbowax)。聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合原理：PEG带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而

8、形成具有共同质膜的融合体。融合过程中应注意①事先要做好两种原生质体的识别标记，如色素、缺陷型、抗性标记等。②原生质体的密度应在105个／mL左右，两种原生质体按1：1等量混合。③常用PEG的分子量通常为4000~6000，加热熔化与Eagle溶液配成50％(W／V)浓度(小分子质量的PEG配成55％浓度)。加入PEG后，24℃培育10~20min注意时间宜短不宜长，过长，使原生质体周围包裹一层膜形成凝集体，会降低融合率)，缓缓