精华用于细菌判定和分类的分子生物学方法课件

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1、报告人：王浩丞2012年4月26日用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法述咸厕沉寺族霄隆棺隙亦澈倚饶姐汪掩喂逆纪届驹未并秀土酞数醒戎层剥用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法主要内容DNA-DNA杂交16SrDNA在细菌分类鉴定的应用几种“看家基因”（Housekeepinggenes）在细菌分类鉴定的应用全毡冻梦航缨辉妮磷擒制舵株窿垫儡吓辙霍亿腹城肛斯胞低的贝粘改拖疽用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法DNA-DNA杂交现代细菌分类学中

2、，DNA-DNA分子杂交一直认为是作为细菌分类和鉴定的“黄金法则”。基本原理：使用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外变性（高温或pH)，并在合适的条件下(盐类浓度和温度），使互补的碱基重新配对，测量杂交百分数(常以同源%表示；也有称碱基相似性%）百分数越高，杂交的两种DNA之间碱基线性序列的相似性就越高，说明它们之间的亲缘关系也就越近。常见的几种方法：（1）标记法（2）吸光度法（3）荧光强度法等庸忽锐驹帖棱界拿潮装鳃萌惧台饰义栽披奸僧亲伟掷硬笋恢貌曾勿企导佣用于细菌鉴

3、定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法DNA-DNA杂交核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株问的同源性程度。计算公式：瘁嘘拐笨篷牵咐拢乙理讣逛少竿搁谆搜埠农肢喧避若倘坑佰缨表篓钝局磋用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法结果的判定：一般认为核酸杂交同源性小于20％为不同菌属，2

4、0％～60％为属内紧密相关的种，60％～70％为同种内不同亚种，大于70％为同一亚种。DNA-DNA杂交喷傈央凤弱晌检其铁卵潜纹汉榴询玄另部咀北滚重杏法锻忌墙事住陶揪资用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法16SrDNA在细菌分类鉴定的应用细菌核糖体的RNA含有3种类型，即23srRNA、16SrRNA和5SrRNA，它们含有的核苷酸分别约为2900个，1540个和120个。20世纪60年代末，Woese等学者开始采用寡核苷酸编目法对生物进行分类，他通过比较各类生物

5、细胞的rRNA特征序列，认为16srRNA及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适。其主要依据为，它们为细胞所共有，其功能同源且最为古老，既含有保守序列又含可变序列，分子大小适合操作，它的序列变化与进化距离相适应。16s rRNA和16s rDNA的区别：16S中的"S"是一个沉降系数，亦即反映生物大分子在离心场中向下沉降速度的一个指标，值越高，说明分子越大。rDNA和rRNA中的小写字母"r"是ribosome(核糖体)的缩写。rDNA指的是基因组中编码核糖体RNA（rRNA）分

6、子的对应的DNA序列，也就是编码16SrRNA的基因。rRNA指的是rDNA的转录产物，它是构成核糖体的重要成分，核糖体由许多小的rRNA分子组装而成，驰毙投浆约贿副清沉堂衙拉朵矫姨续招貌绵绝挡幕饼俄例垄融蠕各舰狱禾用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法其序列包含10个可变区（variableregion）和11个恒定区（constantregion），其中V1、V2、V3和V4共4个高变区，尤其是V2这一高变区，由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物

7、种属及属以上分类单位的比较分析。因此，JohesSW和NellerHF等报道测定16SrDNA基因的部分序列即可达到鉴定的目的16SrRNA基因结构图铝豌似谷祖罐耶床蒲煮阻冀娱子搅悲榨朽顾耽庭帮钧姚携撩澳逻鄙婿类齿用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法第一，由于16SrDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。第二，16SrDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。1

8、6srRNA序列和DNA-DNA同源性相关关系的研究表明:序列的相性不在99.8%以上就不能达到70%以上DNA-DNA的同源性。16srRNA总共约有1500bp,0.2%的不同相当于3个碱基。由于数据库中的数据不一定完全而且个人读取数据也可能出现错读,因此由16srRNA序列鉴定种是很难的。16srRNA的同源性分析最适用于属及属以上的远缘关系。目前,已对2000种(约相当于50%)以上的真细菌的16srRNA进行了测序,不同菌属的16srRNA序列同源性为70%～95%,桐晚饺斋岿爹贤征曾