动物繁殖学课件3体外授精与性别控制

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1、胚胎工厂化生产体外授精技术胚胎移植的技术路线（简览）供体(♀)（优质、高产）超数排卵外源性激素发情配种发情不配种受体(♀♀♀♀)（繁殖性能正常）优秀公牛----同步发情---(前列腺素处理)提供胚胎的母畜（遗传物质的供应者）接纳胚胎的母畜(实际孕育者)胚胎回收妊娠移植重复超排分娩优质高产后代供体超数排卵的局限性异常现象:超而不排、排而不正、不应答、不受精原因因素:个体差异、激素活性、卵巢周期、环境气候不能满足生产的实际需要较难获得不同发育周期的胚胎随着哺乳动物胚胎工程技术的深入研究和商业性胚胎移植技术的迅猛发展，对卵母细胞和胚胎

2、的需求量日益增加。单纯依靠超数排卵获得卵母细胞和胚胎的方法，远远不能满足科学研究和生产的需求。因此，研究和开发卵母细胞体外成熟(IVM)、体外受精(IVF)和受精卵的体外培养(IVC)技术，建立完全在体外条件下快速生产和保存大量优质廉价卵母细胞和胚胎的技术则显得尤为必要。胚胎工厂化生产基本技术路线屠宰场（取回卵巢）吸取卵母细胞体外成熟培养精子（鲜精、冻精）体外获能体外授精（受精率80%以上）受精卵体外培养（分裂率60%以上）胚胎冷冻保存或移植（2-3枚可用胚/卵巢）获能精子1.获取卵母细胞：采集牛卵巢，放入37℃含双抗生理盐水中

3、，6h内运回实验室。用35～37℃的加有双抗灭菌生理盐水清洗卵巢3次，用注射器吸卵巢表面直径为2～5mm卵泡的卵泡液。将抽吸物缓慢注入检卵杯中，静置、检卵。基本方法（以牛体外受精为例）保存输送20-37℃2-6h切割法.抽吸法卵巢回收冲洗分检牛的卵母细胞2.筛选卵丘卵母细胞复合体：将检出卵丘卵母细胞复合体分级。A级：颗粒细胞层完整且紧密，一般为4～6层，胞质均匀；B级：颗粒细胞层较少，一般为2～4层,胞质均匀；C级：颗粒细胞层不全或为裸卵。只选择A，B级卵丘卵母细胞复合体用于成熟培养。ACBDA:A级COCs(100×)；B：B

4、级COCs(100×)；C：C级COCs(100×)；D：D级COCs(200×).3.卵母细胞成熟培养：牛卵母细胞（其他细胞培养基本条件相同）成熟培养条件为5%CO2、39℃、饱和湿度。成熟培养前2h制作微滴，上盖石蜡油后置CO2培养箱中平衡。用培养液对牛卵母细胞进行成熟培养。成熟中成熟后4.卵母细胞成熟鉴定：将培养19～22h的牛卵母细胞分别用D-hank液清洗3遍，放入含有0.3%透明质酸酶的D-hank液内，培养箱中孵育10min，用150μm的毛细玻璃管轻轻吹打以除去颗粒细胞，镜检裸卵母细胞。如果出现第一极体说明卵母细

5、胞已培养成熟，可以与精子共同培养。5.精子体外获能：将精子置于获能液中，体外培养，使精子获能。详见下文。6.受精：将精子和卵子在获能液中共培养，精子和卵子完成受精作用，形成合子，卵裂后，形成早期胚胎。7.早期胚胎培养：将受精卵置于TCM199+血清+添加物的培养液中，体外培养，当胚胎发育至囊胚期时，即可以使用。成熟卵母细胞获能精子+体外受精=注意事项精子密度(1x105/ml)精子活力(不少于0.2)精卵共同孵育不超过6h防止多精入卵体外受精录像影响卵母细胞体外成熟的因素卵母细胞成熟涉及细胞核、细胞质和质膜的成熟变化，但成熟机制

6、仍不是很清楚。卵丘细胞参于卵母细胞的成熟卵丘细胞含有促成熟因子，能提高受精卵原核发育率，这种作用不能被激素所代替。卵丘细胞的扩散能阻断了卵泡液中的成熟分裂抑制因子，使卵母细胞恢复成熟分裂。激素和生长因子具有剂量效应在卵巢上排卵的卵泡是暴露在一个促性腺激素、类固醇激素、生长因子和其它分子处于动态变化的环境中，这些因素分别或协同作用能够影响细胞质的成熟。FSH/LH的剂量浓度影响卵丘细胞扩散及受精卵的分裂;表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)、血小板生长因子(PDGF)、类胰岛素生成素(IGF)等均可影响卵母细胞的成熟。卵

7、母细胞体外成熟的基础系统基础培养剂激素与血清温度与气相成熟评判标准常用细胞培养的基础培养剂多可用于卵母细胞的成熟培养，最常用的为M-199、D-PBS一般多添加犊牛血清(FCS)、牛血清白蛋白(BSA)、FSH/LH、雌激素、表皮生长因子(EGF)等;现有添加同种血清、卵泡液的报道;依据畜种体温温度设定培养，猪需略高于体温(39.5);饱和湿度(95-100%);5%CO2，95%空气;培养36-48h卵丘细胞扩散，第一极体排出是卵母细胞成熟的形态标志。是否能受精、卵裂、发育、产仔是最终评判标准。精子获能精子在雌性生殖道停留一段

8、时间，发生一系列生理生化变化，才能获得与卵子结合的能力，此过程称之为获能(capaciation)。精子获能现象最先是美籍华裔科学家张明觉(1945)证明的。张明觉(1951)首次证明大鼠精子能够在雌性生殖道以外获能并用于受精。1959年，张明觉首次进行了IVF