基因工程（上课）ppt课件

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1、基因工程基因重组(DNA重组):将不同来源的DNA分子通过磷酸二酯键连接而形成新的DNA分子的过程基本概念克隆(clone)是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体分子克隆是在体外对DNA分子按照既定的目的和方案进行人工重组，将重组分子导入到合适的受体细胞中，使其在细胞中扩增和繁殖，以获得DNA分子大量复制，并使受体细胞获得新的遗传特征的过程。基因工程的概念：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.基因工程

2、(geneengineering)常和以下名称混用遗传工程(geneticengineering);基因克隆(genecloning);分子克隆(molecularcloning);基因操作(genemanipulation);重组DNA技术(recombinationDNAtechnique)1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子3、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。4、从大量的细胞

3、繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。5、从这些筛选出来的受体细胞克隆，提取出已经得到扩增的目的基因，供进一步分析研究使用。6、将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出人类所需要的物质。基因工程的主要内容或（步骤）目的基因基因载体重组体分切接转筛表总体技术路线1996年7英国爱丁堡罗斯林（Roslin）研究所用药物促使母羊排卵，将卵吸空，制成空卵壳，再从母羊乳腺中取出一个体细胞，使它与卵壳合成一个含有遗传物质的卵细胞。当卵细胞分裂形成胚胎后被植入母羊子宫内，母羊产下了与自己有相同基因的多莉！第一节　重要的工具酶一、限制性核酸内

4、切酶二、DNA聚合酶三、逆转录酶四、DNA连接酶五、碱性磷酸酶六、末端脱氧核苷酸转移酶一、限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(RE)是由细菌产生的一种能识别双链DNA中的特定位点，并水解该点磷酸二酯键的核酸内切酶(简称限制酶或内切酶)，多在原核生物中存在.⒈限制酶的分类①I型限制酶：具有限制和DNA修饰作用，这种酶通常在识别位点下游100～1000bp处切割DNA；②Ⅲ型限制酶：与I型酶一样，具有限制与修饰活性，能在识别位点附近切割DNA，切割位点很难预测.③Ⅱ型限制酶：能在DNA分子内部的特异位点识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定,是基因工程常用酶。⒉限制酶的命名第一个

5、字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。另外用罗马数字代表同一菌株中不同限制酶的编号，现在常用来表示发现的先后次序EcoRⅠ：E代表Escherichia属co代表coli种R代表RY13株I代表该菌株中首次分离到的核酸内切酶⑴粘性末端在识别序列的两个对称点切开DNA双链，产生带单链尾的粘性末端⒊限制酶的识别和切割位点特点：4-8个bp，具有回文结构的DNA片段⑵平末端：切割点是识别序列的对称轴，产生平端或钝端(bluntend)。如SmaⅠBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCG

6、ACCAGCTGGACCTG+平端切口粘端切口⑶特殊性质的Ⅱ型限制酶：同裂酶：又称异源同工酶，是从不同的原核生物中分离出来的不同的酶。它们识别相同的序列，在切割DNA时，其切割点可以是相同的，也可以是不同的。例如：AhaⅢ和DraⅠ的识别和切割序列都相同，产生平端：又如KpnⅠ和Asp718Ⅰ的识别位点相同，但切割位点不相同，前者产生3'粘性末端，而后者产生5'粘性末端同尾酶(isocaudarner)：有些限制酶的识别序列不同，但是它们作用后产生相同的粘性末端，故称为同尾酶。例如MboⅠ、BamHⅠ、BglⅡ的识别切割序列分别为：二、DNA聚合酶(一)DNA聚合酶I①催化DNA缺口

7、平移反应，制备高比活性DNA探针；②第二条cDNA链的合成；③对DNA3‘突出末端标记；④DNA序列分析。(二)Klenow片段用枯草杆菌蛋白酶可将DNA聚合酶I裂解为36kD和76kD两个片段，大片段称为Klenow片段.具有5'→3'聚合酶活性及3'→5'外切酶活性，而失去了5'→3'外切酶活性。它具有的3'→5'外切酶活性能保证DNA复制的准确性，把DNA合成过程中错误配对的核苷酸去除，再把正确的核苷酸接上去。补齐双链DNA的3ˊ末端。5ˊ-G-OH