流感病毒鉴定课件

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1、流感病毒的鉴定福建省卫生防疫站杨式芹一、原理流感病毒粒表面的血凝素（HA）蛋白，含有识别和结合宿主细胞表面受体的结构。流感病毒的受体为含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白，许多哺乳类动物和禽的红细胞表面均有此两种成分，因此，它们均能被流感病毒所识别和结合，并发生红细胞凝集现象。于病毒悬液中加入特异性的抗流感病毒HA蛋白的抗血清，能抑制红细胞凝集现象出现，即为红细胞凝集抑制试验。流感病毒虽然能凝集多种哺乳类和禽类的红细胞，但应用最广泛的为豚鼠、鸡和人“O”型的红细胞。二、红细胞凝集试验及其抑制试验红细胞凝集及其抑制试验按其容量多寡分

2、为两大类：1）常量法：总容量为0.75ml2）微量法：总容量为常量法的1/10国内把红细胞凝集抑制（HI）测定分为三种：1）常规法2）半加敏法3）加敏法1.材料：标准参照血清即国家流感中心最新公布的甲3（H3N2），甲1（H1N1）和乙型病毒的免疫血清。标准参照抗原即国家流感中心最新公布的H3N2，H1N1和乙型的病毒抗原。质量可靠的受体破坏酶（RDE）。配制好的1%鸡或豚鼠或人的红细胞。0.85%NaCl。干净的大孔塑料板。10ml和1ml吸管或稀释器。试管、三角瓶、试管架，笔。消毒缸、冰盘、37℃和56℃水浴箱。待

3、鉴定病毒。2.操作步骤1）RDE处理标准参照血清2）四个单位抗原的配制3）红细胞凝集滴度计算（见表1）4)四个血凝单位复核测定5）红细胞凝集抑制测定（见表2）6）观察结果：一层红细胞均匀地铺于孔壁上者为++++。基本同上，但边缘不整齐，铺的面积稍小些者为+++。红细胞形成一个环状，四周有小凝集块者为++。红细胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为+。如用鸡红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动像人的眼泪样为-。如用豚鼠或人红细胞形成一个小圆圈，边缘光滑无任何小凝集者为-。“±

4、”即为可疑，计算时以“-”（阴性）处理。计算时请参考以下口诀：①先整后算。表1中，1-4，6和7不必进行整理，而5中，必须将1:640处一个加号挪到1:320处，使1:320处为4个加号，而1:640处变成两个加号，然后再进行计算。②两个加号不用算。如表1中3，其滴度为640。③小，小本身的1/8。如表1中2，1:640处仅一个加号，故其血凝滴度一定少于640，计算之：640-640/8=560。④大，大本身的1/4。同理4中血凝滴度一定大于640，计算之：640+640/4=800。⑤两个极端取中间（均数）。如表1中

5、1，1:320时4个加号，而1:640时阴性，计算之：320+640/2=480。表中6结果表明，血凝滴度未抓住，它必然大于1280，也可能成≥1920。因1:1280的高一个稀释度为1:2560，1:2560时可能出现的结果应从“–”至“++++”，当“–”时，滴度为1920，其余情况下均大于1920。当然要想知道精确的滴度应重新滴定，直至终点抓住为止。7中是否有血凝滴度？不清楚，其血凝滴度肯定<10，同理1:5处可能出现–～++++。当出现++++时，血凝滴度应为7.5，其余情况下均小于7.5。四个血凝单位计算：将

6、血凝单位除以4，表1中1它的四个血凝单位应为：480/4=120，即将标本1进行1:120稀释时，其稀释液就是含四个血凝单位。请注意！1:120稀释应为1ml病毒悬液加119ml稀释液（一般为生理盐水）。同样计算之前，有些结果必须进行整理，如6中，必须把1︰320处一个加号挪到1︰640处，使1︰320处变成“–”，而1︰640处变成“++++”，然后再进行计算。X=Y+Y/4·ZX为需求的血清效价，Y为能引起血凝全部抑制最高血清稀释度的倒数，Z为4减掉不能被抑制数（指全抑制高一个稀释度处）。鉴定结果判断：（1）标准参

7、照血清对分离的抑制效价达≥20才可算为阳性。（2）一个分离物不能被两种或以上标准参照血清同时有≥20的抑制。（3）一个分离物被H3N2免疫血清有≥20抑制，而H1N1和乙型免疫血清抑制效价均<20。可认为分离物H3亚型病毒，同理仅被H1N1免疫血清有≥20或仅被乙型免疫血清有≥20抑制，可认为分离物为H1亚型病毒或乙型病毒。（4）三种标准参照血清对分离的抑制物效价均<20，速将分离物送国家流感中心进一步鉴定。交叉血凝抑制测定和抗原比计算由于流感病毒的抗原性能经常不断地发生变异，变异程度与疾病发生与流行强度常成正相关。交

8、叉血凝抑制测定和抗原比计算仍为最简便、可靠和敏捷地了解流感病毒抗原性是否已发生变异，其变异幅度有多大的一种手段。三、流感实验室检测中应注意的若干问题1.禁止在同一实验室和同一接种柜中，同时处理接种未知临床标本和已知阳性标本。2.禁止在同一实验室，同一时间处理接种采至不同动物的标本。动物的标本必须与人的标本分别保存。3.接种后剩余原