第三章 抗体的制备与纯化技术

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1、大家下午好！第二篇分子免疫学技术授课内容一、特异性抗体的制备与纯化技术二、蛋白质研究水平的分子免疫学技术四、基因组和蛋白质组研究水平的分子免疫学技术授课方式：讲授、自学、演示相结合三、DNA研究水平的分子免疫学技术第三章特异性抗体的制备与纯化技术绪论特异性抗体：多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体（杂交瘤技术）基因工程抗体第一节多克隆抗体的制备与纯化多克隆抗体：由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同抗原决定簇的抗体的混合物，即多克隆抗体。多克隆抗体（抗血清）的制备流程抗原半抗原+载体佐剂免疫动物（3-5

2、次）测效价动物采血，分离血清抗血清纯化、鉴定、保存一、抗原制备1、抗原的制备1）细胞性抗原或颗粒性抗原：细胞性抗原主要包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面；置温箱37℃培养24h，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀菌体；100℃水裕2～2.5h杀菌并破会鞭毛抗原。取处理过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8亿～10亿个细菌，加入苯酚至最终浓度为5％，即为O抗原。2）可溶性抗原可溶性抗原主

3、要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、补体、细菌外毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞，成分复杂。制备这类抗原时，首先需将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后的抗原需鉴定后才能用做免疫原。（1）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管，在4℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。（2）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理

4、法等。超声破碎：一次超声1～2min，总时间为10～15min。（3）蛋白提纯①超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油、CsCl；②选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33～50％饱和度的硫酸胺收集沉淀物；③凝胶层析法（分子筛层析）：蛋白质分子按大小被分离；④离子交换层析；带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时

5、的结合力大小的差别而进行分离⑤亲和层析：利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体、激素受体、IgG和葡糖球菌蛋白蛋白A（SPA）；⑥制备电泳技术。⑦其它聚丙烯酰胺凝胶胶内蛋白可将抗原所在的电泳条带（或蛋白点）切下,研磨后直接用以动物免疫。NC膜结合蛋白将含目的分子的蛋白进行SDS-PAGE电泳，转移至NC膜上，丽春红显色至清晰显示目的条带，取目的条带置于加有PBS的1.5ml离心管中，用PBS洗至无色，继而剪碎、研磨，用于动物免疫。（4）纯化抗原的鉴定含量测定：采用常规蛋白或糖类浓度测定法，一般采用分光光度计测量法；相对分子

6、量的鉴定：一般采用SDS-PAGE电泳法；纯度鉴定：常用区带电泳法鉴定。3）半抗原半抗原物质多数为低分子质量的物质，如：多糖、多肽、甾体激素、脂肪胺、类脂质、核酸、某些药物及其它化学药品；常用载体：蛋白质类如：牛血清白蛋白、人血清清蛋白、兔血清清蛋白等。多肽聚合物：如多聚Lys大分子聚合物：如羟甲基纤维素；半抗原－载体连接方法：常用物理法和化学法，物理吸附的载体有羟甲基纤维素等，其借助电荷和微孔吸附半抗原，化学法则是利用某些功能基团把半抗原连接到载体上。2.佐剂1）定义：与抗原同时或预先注射于机体能增强机体免疫应答或改变

7、免疫类型的物质.2）良好的佐剂应当具备以下条件：（1）增加抗原的表面积，并改变抗原的活性基团构型，从而增强抗原的免疫原性；（2）佐剂与抗原混合能延长抗原在局部组织的存留时间，降低抗原的分解速度，使抗原缓慢释放至淋巴系统中，持续刺激机体产生高滴度的抗体；（3）佐剂可以直接或间接激活免疫活性细胞并使之增生，从而增强了体液免疫；（4）具有无毒性或副作用低的特点。3）常用佐剂的种类和制备应用最多的是福氏佐剂和细胞因子佐剂福氏佐剂：不完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂完全佐剂:液体石蜡+羊毛脂+卡介苗福氏佐剂：抗原=1：1乳化成“油包水”

8、乳液（乳化方法主要有研磨法和注射器混合法）。完全佐剂一般不连续2次使用细胞因子佐剂IL-2IL-1IFNrCSF等二、免疫血清的制备1、免疫动物的选择和饲养选择动物:哺乳类和禽类1)适龄、健壮、无感染2）抗原与免疫动物种属关系：差异越远越好3）抗血清量的需要：量大，选用马、羊等大动物，量小，选用兔、豚鼠4）实验考虑：