黄芪甲苷的提取及抗结核作用研究

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1、黄芪甲苷的提取及抗结核作用研究：从黄芪（RadixAstragalus）中提取黄芪甲苷，将其作用于THP-1细胞和THP-1吞噬结核杆菌菌株H37Rv模型，考察黄芪甲苷促进THP-1吞噬结核杆菌的效果。结果表明，黄芪甲苷能强化THP-1细胞活力和其吞噬H37Rv的能力，且试验范围内黄芪甲苷浓度越高作用效果越强。　　关键词：黄芪（RadixAstragalus）甲苷；提取；THP-1；结核杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）　　：R284.2；R285.5；R378.91+1：A：0439-8

2、114（2013）11-2632-02　　结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）俗称结核杆菌，是引起结核病的病原菌，可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见[1]。目前，结核病治疗主要采用异烟肼等药物，但存在耐药性等问题。黄芪（RadixAstragalus）又名黄耆，为豆科植物膜荚黄芪（Astragalusmembranaceus）的根，是一种常用中药，分布于我国内蒙古、山西等地区，具有补气固表、利水退肿等功效。现代研究表明，黄芪中所含的甲苷、黄酮等成分能够有效增强机体的免疫功能[2，3

3、]。有报道显示黄芪能够强化巨噬细胞活力，帮助人体抵御并杀灭结核杆菌[4，5]。本研究从黄芪中提取黄芪甲苷，将其作用于THP-1细胞和THP-1吞噬结核杆菌H37Rv菌株模型，检验黄芪甲苷促进巨噬细胞吞噬结核杆菌的功效，为黄芪活性成分的开发利用及抗结核病新药的研发奠定基础。　　1材料与方法　　1.1材料与仪器　　1.1.1材料与试剂黄芪购自安国市宝盛中药材有限公司，保存于河北经贸大学生物科学与工程学院材料库；结核杆菌H37Rv菌株和THP-1白血病细胞株来自河北医科大学生化研究所。RPMI-1640培养基，青岛日水

4、生物技术有限公司；胎牛血清，上海基峰生物有限责任公司；二甲基亚砜，姜堰市奥伦合成树脂有限公司；聚赖氨酸，兰州伟日生物工程有限公司。　　1.1.2主要仪器MZ型高速粉碎机，青岛迈科隆粉体技术设备有限公司；360EP电子天平，上海精科天美贸易有限公司；RE-2000A旋转蒸发器，上海一凯仪器设备有限公司；KNF循环水真空泵，上海诚铭科技有限公司；紫外可见分光光度计，上海天普分析仪器有限公司；BDS200-PH倒置相差显微镜，天津西格光电科技有限公司；CO2培养箱，上海三腾仪器有限公司；LP-160B数字酸度计，上海厚

5、望科学仪器有限公司；BZY-1恒温槽，上海衡平仪器仪表厂；FZG真空干燥箱，南京康方机械科技有限公司；DG5033A酶联免疫检测仪，南京华东电子集团医疗装备有限责任公司。　　1.2试验方法　　1.2.1黄芪甲苷的提取将黄芪干燥并粉碎，取150g黄芪粉末，用1500mL体积分数75%的乙醇在80℃加热回流提取3次，每次加热回流提取时间分别为48、24、24h。减压浓缩得乙醇浓缩液，再经85℃水浴处理60min后用石油醚萃取。萃取后得到的溶液加入正丁醇，充分振摇，重复提取5次，合并提取液。加入氨试液25mL，充分振摇

6、，重复提取3次，获得黄芪甲苷提取液。　　1.2.2黄芪甲苷含量测定取黄芪甲苷标准品5.0mg，加无水乙醇溶解，混匀并定容至10mL得到黄芪甲苷标准液，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL黄芪甲苷标准液，用无水乙醇稀释至0.5mL，再加入10%的香兰素乙醇溶液0.5mL，经冰水浴处理后，加入70%的硫酸定容至10mL，摇匀。以未添加黄芪甲苷标准液的处理为空白对照，测定其在544nm波长处的吸光度，得到黄芪甲苷浓度（C//mg/mL）对吸光度（A544nm）的线性回归方程为A=0.932C+0.047，相

7、关系数r=0.9887。　　1.2.3THP-1细胞的培养THP-1细胞复苏解冻后，置于含15%小牛血清的RPMI1640细胞培养基内，培养条件为CO2浓度8%、温度36℃。THP-1细胞生长到指数生长期时调整细胞浓度为1.5×105cell/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔加培养基至体积为2mL，在CO2浓度8%、温度36℃的环境下继续培养72h。　　1.2.4黄芪甲苷对THP-1细胞活力影响将THP-1细胞培养至分化阶段，在2mL培养基中加入25μL含不同浓度黄芪甲苷（0、0.10、0.25、0.40mg/

8、mL）的RPMI1640培养液，培养箱内再培养36h，加入25μL5mg/mL的噻唑蓝，继续培养6h，经离心处理后，吸去培养板孔内的培养基，各孔中加入160μL二甲基亚砜，充分振荡之后测定各孔光密度值（OD），取平均值。　　1.2.5结核杆菌预处理取2mL经过灭活处理的H37Rv加入15mL培养基混匀，控制菌浓度为5×106CFU/mL。　　1：从黄芪（RadixAstr