内源性活性物质ppt课件

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1、体内药物分析内源性活性物质的分析王伟内源性活性物质1、定义内源性生物活性物质是指人类和哺乳动物体内天然存在的具有生理功能和生物学活性的物质，它们可以是小分子化学物质，也可能是糖类、生物活性肽类、核苷和核酸、生长因子、内源性调节因子、细胞因子和蛋白质等。2、研究意义许多重大的突破都是由于发现了体内那些具有重要生理活性的物质，并发现调节这些物质的其它相关物质。基因克隆使“受体一指导”和“酶一指导”的新药的发现在方法学上得到完善。DNA重组和转基因技术的发展已使蛋白质和肽类药物的生产及其它内源性分子作为新药成为可能。蛋白质类内源性活性物质的分析WesternBlotWe

2、sternBlot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。荧光探针定义：与蛋白质、核酸(DNA或RNA)或其他大分子结构非共价相互作用而使一种或几种荧光性质发生改变的小分子物质。可用于研究大分子物质的性质和行为。荧光探针荧光探针除应用于核酸和蛋白质的定量分析外，在核酸染色、DNA电泳、核酸分子杂交、定量PCR技术以及DNA测序上都有着广泛的应用。可以分为荧光素类探针、无机

3、离子荧光探针、荧光量子点、分子信标几类与G蛋白偶联受体相关的内源性活性物质对心肌细胞功能和形态的影响免疫组织化学法免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫化学技术近年来得到迅速发展。50年代还仅限于免疫荧光技术，50年代以后逐渐发展建立起高度敏感，且更为

4、实用的免疫酶技术。免疫组织化学染色法免疫组织化学染色法是指在抗体上结合萤光或可呈色的化学物质，利用免疫学原理中抗原和抗体间专一性的结合反应，检测细胞或组织中是否有目标抗原的存在，此方式不只可以用来测知抗原的表现量也可观察抗原所表现的位置。只要是能够让抗体结合的物质，也就是具有抗原性的物质包括蛋白质、核酸、多糖、病原体等都可侦测。免疫组织化学染色法免疫组织化学的优势在于专一性、灵敏度、简便快速以及成本低廉，所以广为医院采用，通常是借由特定的肿瘤标记来筛选癌症。免疫组织化学染色法对基础研究及预防和诊疗上都是相当重要的一个方法。发光免疫测定luminescenceimm

5、unoassay;LIA;luminescentimmunoassay将发光系统与免疫反应相结合，用于检测抗原或抗体的技术。以发光物质标记抗原或抗体，免疫反应后引发发光反应，根据发光强度对抗体或抗原进行的测定。层析chromatography基于不同物质在流动相和固定相之间的分配系数不同而将混合组分分离的技术。当流动相(液体或气体)流经固定相(多孔的固体或覆盖在固体支持物上的液体)时，各组分沿固定相移动的速度不同而分离。能用于微量样品的分析和大量样品的纯化制备。层析是应用蛋白质的等电点不同而分析分离蛋白质的。双向凝胶电泳（2D胶电泳）的基本原理先将蛋白质根据其等电

6、点在pH梯度胶内进行等电聚焦，然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。第一向进行等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动。移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点pH位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。当蛋白扩散到低于其等电点pH区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动。同样，如果蛋白质扩散到高于其等电点的pH区域时，则带负

7、电，在电场的作用下会向阳极移动。根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH梯度介质区域内。目前常使用预制胶条(IPG,immobilizedpHgradient)用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的IPG胶条在含有SDS的缓冲液中平衡。第二向是将在IPG胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到SDS-PAGE凝胶上，根据蛋白质的相对质量或分子量(MW)大小与第一向相垂直的分离。沿垂直的方向进行SDS-PAGE电泳（聚丙烯酰氨凝胶电泳），按分子量大小进行分离。样品经过电荷和质量两次分离后，得到等电点和分子量的信息。IPG胶的材料是Immobilines，为拥有

8、CH2=C