原理与技术ppt课件

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PCR原理与技术王秀娟Ph.D.candidatewangxj@bjmu.edu.cn PCR-polymerasechainreaction聚合酶链式反应，实际上是一种体外的DNA复制技术。因此，它的过程与体内DNA复制有相似之处，只不过在体外就得采取体外的技术方法达到生物体内的效果。体内DNA复制首先是将双链DNA打开，使用的是解旋酶。PCR技术是通过升高温度变性的方法。体内DNA复制的引物由RNA聚合酶来完成，PCR是通过降温使人工合成的引物退火。延伸都是聚合酶发生作用的阶段，只不过体内体外的温度不同。PCR原理 PCR过程：变性、退火、延伸，此过程循环反应。变性就是将双链的DNA打开，使其变成单链，以使引物可与其结合（碱基互补配对）。变性的方法就是升高温度到94℃-98℃，温度因酶而异。退火就是缓慢降低变性温度至引物与模板结合。延伸就是将温度升到聚合酶活性最佳温度，进行聚合反应。以上3个过程完成一次为一个循环，一般PCR可以进行25-35次循环。扩增2^25-35倍。PCR原理 从PCR的过程可知道，PCR反应的进行需要的条件为：DNA聚合酶模板引物原材料和能量——dNTP反应发生所需要的水盐环境还有外部环境条件——温度（PCR仪提供）PCR原理 94℃3min（预变性）94℃30s（变性）60℃30s（退火）72℃1min（延伸）72℃10min（充分延伸）4℃hold（可有可无）PCR经典反应条件25-35个循环 Taq酶（有很多种聚合酶）Buffer（反应所需要的缓冲液，含镁离子等）dNTP模板DNA（来自基因组DNA,质粒，cDNA等）引物DNA（公司合成）无核酸酶的水PCR反应体系 （4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等浓度过高易产生错误碱基的掺入,浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合,使游离的Mg2+浓度下降,影响DNA聚合酶的活性PCR反应体系参数 （5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度PCR反应体系参数 （1）变性使双链DNA解链为单链94℃20-30秒（2）退火温度由引物长度和GC含量决定。增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。循环参数 （3）延伸70-75℃,一般为72℃延伸时间由扩增片段长度决定（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加循环参数 PCR动画 引物设计原则①引物设计必须具有特异性，应在没有同源序列的区域内设计②引物长度一般在15~30碱基之间③G+C含量在40%~60%之间④引物尽量不形成二级结构，引物之间尽量不形成二聚体⑤碱基要随机分布，引物自身不能有连续5个以上的相同碱基⑥引物5′端可以修饰，引物3′端必须严格互补⑦引物3′端要避开密码子的第3位，并且尽量不要用A⑧引物设计要跨内含子或隔内含子⑨注意mRNA有不同的isoform，不同的引物可能针对不同的isoform进行扩增 引物设计常用资源PrimerPremier5Oligo6BeacondesignerPrimerExpress®Software（ABcorporation）普通引物设计及分析网上real-time引物库Primerbankhttp://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/real-time引物设计专用 普通PCR反转录PCR（rt-PCR）巢式PCR反向PCR不对称PCR实时PCR（real-timePCR，RT-PCR）http://www.doc88.com/p-081712353458.htmlPCR的种类 反转录PCR是一种将逆转录和PCR技术偶联起来，检测基因表达的转录水平的一种技术。它是先利用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后以cDNA为模板做PCR。常用的逆转录酶有：鸟成髓细胞瘤病毒来源的AMV、Moloney鼠白血病病毒来源的M-MLVrt-PCR有一步法和两步法两种。rt-PCR 18一步法：逆转录和特异性扩增在一管内完成，需用基因特异性引物两步法：先逆转录得到cDNA，再分别进行扩增，需用OligodT或随机引物两者区别：一步法简单，减少污染的几率，可适用于大量样品和定量分析，但一次只能分析一个基因，cDNA不能重复利用；两步法比较灵活，一次逆转录可以检测多个基因，方便进行比较，推荐使用两步法一步法和两步法 逆转录模板：提取的RNA底物：dNTP引物：OligodT适用于真核生物的mRNA逆转录，对RNA样品质量要求高，甚至可以得到全长cDNA。随机引物适用于长的、低丰度的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的逆转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。 20 总RNA提取步骤（以细胞为例）1、将细胞（六孔板、6cm培养皿）用冷PBS洗一遍，弃去PBS2、向培养皿中加1mlTrizol，反复吹打，并转移至1.5mlRNAsefree的EP管中，室温放置5min，使细胞完全裂解3、加入200ul氯仿，剧烈摇晃15s，12000rpm离心15min，4℃4、转移上清500ul至一个新的1.5mlRNAsefreeEP管中5、加入500ul异丙醇，充分混合，室温放置10min，12000rpm离心10min，4℃ 6、弃去上清液，此时可见白色RNA沉淀7、加入1ml75%乙醇，轻轻洗沉淀，12000rpm离心5min，4℃8、小心弃去液体，开盖放置EP管，等待沉淀完全干燥9、加入30~100ulRNAsefreeH2O，溶解RNA10、将EP管放置60℃加热器中10min，助溶RNA11、定量12、-80℃保存 RNA质量的鉴定分光光度法：OD260/2801.9~2.1:RNA纯度好小于1.8：有蛋白或酚污染大于2.2：RNA降解用TE（Tris-HCl-EDTA)洗脱，OD260/280会偏大（2.0～2.3）ⅠⅡ琼脂糖电泳法：28S亮度约为18S的两倍28S18SFrominternet 24RNA提取的注意事项新鲜组织、细胞低温操作（如液氮研磨，冰上处理）低温保存（-80℃），勿反复冻融所有仪器、试剂均要进行无RNAse处理，尤其是水操作人员戴帽子、口罩，勤换手套使用RNAse抑制剂 RT-PCRReal-timePCR，是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时监控反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。使用仪器：荧光实时定量PCR仪，是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪,通常配有电脑系统及相应的分析软件 普通PCR：终点定量，结果不稳定，反应环境、循环次数对结果影响较大，不能定量起始DNA模板数量。Real-timePCR：灵敏度高（SYBRgreen法）/特异性高（分子信标、Taqman法），线性关系好，高通量，可定量起始DNA模板数量。普通PCR与real-timePCR的比较 内掺式染料SYBRGreenI序列特异性探针TaqmanMolecularBeaconsDualProbes(FRET)引物特异性探针Amplifluor(Intergen)荧光定量PCR标记方法 5’3’5’3’SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR-GreenI 5’3’5’3’SGSGSGSGSGExcitationEmissionSYBR-GreenI 30Taqman法：以Taqman探针为基础，Taqman探针是两端分别标有荧光发射基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸，探针完整时，两基团靠近，不能检测到荧光信号，当特异性扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性使探针降解，两基团分开，此时可检测到荧光并实现荧光的积累。FromABcorporation 在普通引物设计的基础上，还要注意引物要短，15～25为好引物内部不能有二级结构，引物之间不能形成二聚体产物片段不能太长，以100～250为好Tm值在60℃左右为好产物必须是单一的real-timePCR引物设计原则：real-timePCR探针设计原则：探针序列要保守，与靶DNA要完全互补，无非特异结合同时考虑在两条链上设计探针探针位置尽可能靠近上游引物长度通常20～30bp，Tm65～70℃，GC含量40～70%，C比G明显多探针5’端避免使用G，以免淬灭探针 Real-timePCR检测实例（以SYBRgreenⅠ法为例）SYBRgreenⅠ法既可以绝对定量又可以相对定量绝对定量：未知样本DNA拷贝数通过从已知量的标准品的标准曲线中直接推算出相对定量：不需知道样本DNA拷贝数，通过与同一样本中内参的比较得出样本DNA的相对丰度，用于样品之间比较 Xn=X0(1+Ex)n=M实际PCR扩增产物增加的数学模型：n:循环数X0:初始模板量EX:扩增效率（Ex=0~1)Xn:n次循环后终产物的量Real-timePCR可用于定量检测的数学原理理想PCR扩增产物增加的数学模型：Xn=X0×2n PCR扩增效率小于1的原因反应体系有限终产物增加对反应的抑制酶活性下降酶-模板复合物饱和引物消耗离子浓度变化 XCt=X0(1+Ex)Ct=M取对数logXCt=logX0(1+Ex)Ct=logMlogXCt=logX0+log(1+Ex)Ct=logMlogX0=-Ctlog(1+Ex)+logMCt:反应产物的量达到阈值时的循环数0logX0CtReal-timePCR可用于定量检测的数学原理 36阈值：real-timePCR中预先设定的荧光信号强度，当反应中荧光信号达到阈值后，收集到的信号才被认为是有效信号阈值阈值可由机器自动设置，也可手动设置，机器默认3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍作为阈值 相对定量很多时候我们不需要知道样品的绝对量，只需要知道样品比对照组是增多（减少）多少倍，因此不需要做标准曲线，把样本直接和对照组来比较得出相对值。相对定量的方法：同一样本要做内参的检测，内参常选用管家基因，如GAPDH。内参的特点是在所检测的所有样品中有恒定高量的表达。内参的高低可以反应样本量的多少。不论是绝对定量还是相对定量都需要做4个复孔。 由SYBRGREEN染料的特点我们可以知道，PCR的产物必须单一，引物必须没有二聚体形成，否则PCR杂带和二聚体形成的双链也会被误收集而干扰结果。所以，引物设计很关键。如何在软件上判断引物是不是良好，需要观察溶解曲线。好的溶解曲线是一条单一的峰。 39在AB7300real-timePCR仪上创建反应文件FromABcorporation 40创建绝对定量反应板（相对定量也用这个程序） 41选择荧光SYBR和参比荧光ROX 42选择要进行反应的孔，单击SYBR前的复选框 43给反应孔命名 44切换到instrument选项卡，设置反应条件，反应体系并添加融解曲线 45在File菜单中选SaveAs，保存反应板文件 46单击Start，开始反应 47切换到Results选项卡，观察扩增曲线，确定阈值 48观察融解曲线 49切换到Report选项卡，在File菜单选择Export导出结果 2-ΔΔCt分析法假设扩增效率为100%X0=M/2n实验组检测基因：X实验=M/2Ct1实验组内参基因：X实验=M/2Ct2同理对照组检测基因：X实验=m/2Ct3对照组内参基因：X实验=m/2Ct4实验组/对照组==2-（（ct1-ct2）-（ct3-ct4）)M=Xn=X0×2nM/2Ct1M/2Ct2m/2Ct3m/2Ct4 谢谢！2012-08-15