流式细胞仪分析技术及应用课件_2

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1、流式细胞仪分析技术及应用第一节概述一、工作原理二、散射光的测定三、荧光测量四、细胞分选原理第二节数据的显示与分析一、参数二、数据显示方式三、设门分析技术第三节流式细胞仪免疫分析的技术要求一、免疫检测样品制备二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色三、免疫胶乳颗粒的应用四、流式细胞免疫学技术的质量控制第四节流式细胞术在免疫学检查中的应用一、淋巴细胞及其亚群的分析二、淋巴细胞功能分析三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型四、肿瘤耐药相关蛋白分析五、AIDS病检测中的应用六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析七、移植免疫中的应用第五节流式细胞术在细胞凋亡研究中的应用前言流式细胞术：七十年

2、代发展起来的,集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,同时具有分析和分选细胞功能。测细胞大小、内部颗粒性状,检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,对群体细胞在单细胞水平上进行分析,短时间内检测分析大量细胞;分类收集某一亚群细胞。常用的由美国生产:BECKMAN-COULTER公司和Becton-Dickinson公司(B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（小型机、台式机）和综合型（大型机、分析型）。流式细胞术(flowcytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分选的新技

3、术。能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术的特点高速度：对细胞的标准分析速度达到了2x104个/min，最大分析速度达到6x104个/min。高灵敏度：一般以能检测到单个微球上最少标记有异硫氢酸荧光素(FTTC)或藻红蛋白((PE)荧光分子数目来表示。高准确度：可检测两个细胞间细胞成分仅相差1%左右的细胞。流式细胞术的特点2021/8/12分析速度：一般每秒检测1000～5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。荧光检测灵敏度：一般能

4、测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间荧光差＞5%即可区分。前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。流式细胞术的特点2021/8/12分辨率：通常用变异系数CV值来表示，一般能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。流式细胞术的特点流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗

5、原等）进行快速测量并可分类收集的高技术。第一节概述细胞组成细胞功能大小细胞表面/胞浆/核--特异性抗原粒度细胞活性DNA,RNA含量胞内细胞因子蛋白质含量激素结合位点钙离子,PH值,膜电位酶活性流式细胞仪常检测的细胞特性采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。一、工作原理（1）液流系统（2）光学系统（3）数据处理系统1.流式细胞仪的基本结构由样本和鞘液组成待测细胞单个细胞的悬液荧光染料标记的单

6、抗对其染色受清洁气体压力从样品管进入流动室形成样本流鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。（1）液流系统喷嘴FluorescencesignalsFocusedlaserbeam鞘液液流系统示意图FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管液流系统作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，理想状态是把细胞传送到激光束的中心。且在特定时间内，只有一个细胞或粒子通过激光束。必须在流动室内把细胞注入鞘液流。流动室是液流系统的核心部件，台式机中流动室称为样品槽，大型机称之为喷嘴。在流动室内细胞液

7、柱聚焦于鞘液中心，细胞在此与激光相交。样本压力和鞘液压力不同，且样本压力总大于鞘液压力。样本压力调节器通过改变样本压力的方法控制样本流速。细胞液柱通过样品槽产生流体聚焦液流系统高流速使样本流变宽，细胞间距离缩短，在单位时间内流经激光照射区的细胞数量增加，可快速获取数据。适于定性测量（免疫表型）。低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细胞受激光照射的能量比较均一。适用于检测分辨率要求高的实验（DNA分析）。为确保粒子和细胞完全通过激光束，正确