老碾尿素通道蛋白基因敲除鼠急性缺氧耐受能力下降的研究

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1、老碾尿素通道蛋白基因敲除鼠急性缺氧耐受能力下降的研究作者：周磊孟艳苏静杨宝学赵雪俭【摘要】目的探讨老年尿素通道蛋白B基因敲除鼠与老年野生鼠对急性缺氧耐受力的差异，并探讨其发生的可能机制。方法小鼠的DNA提取及其PCR基因型鉴定；mol/L尿素溶血实验；急性缺氧实验；心肌超微结构观察。结果通过mol/L尿素溶血实验发现UTB敲除后红细胞对于高浓度尿素的抵抗性增高；急性缺氧实验发现老年UTB基因敲除鼠对急性缺氧的耐受力明显降低；心肌超微机构观察显示UTB基因敲除鼠线粒体数目减少，排列紊乱，界限不清，嵴肿

2、大或消失。结论老年UTB基因敲除鼠对于急性缺氧的耐受力下降可能是由于UTB基因的敲除影响了红细胞及心肌线粒体的完整性及功能。【关键词】UTB；缺氧；线粒体红细胞膜和肾集合管末段对尿素的通透性远远高于脂相单纯扩散,提示尿素跨膜转运由尿素通道蛋白(ureatansporters，UTs)介导〔1〕。1994年又从人骨髓中分离出了另一个UTs家族成员UTB的cDNA。至今被克隆的UTs包括两个家族,肾小管型UTA和红细胞血管型UTB。Northern印迹法分析人和大鼠组织发现,UTB的mRNA分布

3、广泛。UTB在红细胞和肾脏髓质降直小血管高表达，并广泛分布于心脏、骨骼肌、结肠、小肠、脑、胸腺、前列腺、肝脏、卵巢、肾盂、膀胱中〔2，3〕。本实验室Yu等〔4〕对比观察了6、16、5w龄3个不同组的UTB基因敲除鼠与同龄野生型小鼠的肢体标准导联心电图结果，UTB基因敲除鼠PR间期明显长于野生型鼠，且老龄组(5w龄)Ⅱ度和Ⅲ度房室传导阻滞发现率超过20%。提示UTB基因敲除后，老年鼠出现心肌功能改变。本实验拟通过急性低张性缺氧实验，观察老年UTB敲除鼠和老年野生鼠对急性缺氧耐受力的差异。1材料与

4、方法动物UTB基因敲除纯合型鼠(UTB/)〔4〕，由杨宝学教授提供。小鼠在洁净层流架内按照SP级小鼠饲养标准饲养，室温18℃～22℃，湿度50%～60%。小鼠基因组DNA的提取及基因型的PCR鉴定剪切鼠尾mm，剪碎加入消化液20μl，55℃水浴h，加入200μl蒸馏水，100℃水浴min，1000r/min离心1min，弃沉淀，余上清即为DNA。基因型鉴定引物：上游引物(S)：5′GGATCTGCCTTCCAAGAAACTCGTGTC3′;下游引物1(AS1)：5′GTATGGCTTCTGA

5、GGCGGAAAGAACC3′；下游引物2(AS2)：5′CAGGCCAGAGGGACAGCACAAACA3′。上游引物与下游引物1、2配成两重PCR反应体系，其中AS1产物400bp，AS2产物280bp。一份DNA样本如果只能扩增出产物400bp，提示其有正常的UTB基因，为UTB野生型鼠；如果只能扩增出产物280bp，提示其为UTB敲除纯合型鼠；如既扩增出的产物1同时具有400bp和280bp两条产物带，提示其为UTB杂合型鼠。mol/L尿素溶血试验4孔培养板中加入mol/L尿素溶液6

6、00μl，取鼠抗凝静脉血1μl加入尿素溶液中，倒置显微镜观察0、1、4、10min时红细胞的形态变化与溶血过程，拍照记录。以生理盐水替代mol/L尿素溶液作为阴性对照。急性低张性缺氧实验实验鼠均为雌性，5w龄，重量33～3g，实验分为UTB敲除和野生组各6只。缺氧实验在250ml磨口烧瓶中进行，瓶口用石蜡油密封，瓶内装30g碱石灰，直到鼠缺氧死亡。观察心肌超微结构形态改变取心肌组织于3%戊二醛中固定，再以1%锇酸固定，在H600电子显微镜下观察心肌超微结构。结果统计本实验数据均采用x±s表示，应用SP

7、SS统计软件包处理。结果.1基因型鉴定见图1。PCR鉴定结果显示UTB敲除纯合型在280bp出现条带，野生型在400bp出现条带，杂合型在400bp和280bp同时出现两个条带。图1PCR鉴定小鼠UTB基因型.2生存时间如图2所示,敲除纯合子生存时间少于野生型。图2急性缺氧小鼠存活时间.3心肌细胞超微结构改变见图3。野生组的心肌细胞线粒体排列整齐，数目较多，嵴正常。UTB/组可见线粒体数目减少，排列紊乱，界限不清，嵴肿大或消失，基质密度减低。图3心肌细胞超微结构观察.4mol/L尿素溶血实验UT

8、B+/+小鼠及UTB+/小鼠的红细胞加入mol/L尿素溶液后，均在1min之内溶血(图E)，无差异，提示小鼠红细胞对尿素通透性高，表现正常溶血反应。UTB/小鼠的红细胞在mol/L尿素溶液中，1min时细胞的体积无变化(图4B)，如在％NaCl溶液中(图4A)，但数量开始减少；min时细胞体积开始膨胀，数量进一步减少(图4C)；随着时间延长，min时视野中只剩极个别细胞(图4D)，10min左右细胞在视野中消失，提