罗格列酮改善高脂饲养大鼠胰岛素抵抗机制的研究

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1、罗格列酮改善高脂饲养大鼠胰岛素抵抗机制的研究【摘要】目的探讨罗格列酮改善高脂饮食大鼠胰岛素敏感性的机制。方法SD大鼠随机分为正常对照组、高脂饮食对照组、高脂饮食罗格列酮治疗组，治疗组灌服罗格列酮。采用葡萄糖-胰岛素耐量实验测量大鼠胰岛素敏感性K值，并观察不同部位脂肪组织重量的变化及其与胰岛素敏感性K值的关系。采用RT-PCR法检测大鼠腹腔脂肪组织中TNF-α、leptin、PPAR－γ表达的变化情况；应用TUNNEL法观察腹腔脂肪细胞凋亡的变化。结果周后，高脂饮食罗格列酮治疗组大鼠与高脂对照组相比，胰岛

2、素抵抗明显改善，K值升高；腹腔脂肪重量减少，皮下脂肪重量相对增加；腹腔脂肪组织TNF-α、leptin表达量明显下降，PPAR-γ表达未见改变；大鼠腹腔脂肪细胞凋亡增加。但与正常对照组相比未见明显差异。结论胰岛素抵抗与腹腔脂肪组织关系密切；罗格列酮改善高脂饮食大鼠胰岛素敏感性的机制可能是通过调控脂肪细胞凋亡，影响脂肪细胞的分布，减少引起胰岛素抵抗的细胞因子的表达，从而改善胰岛素抵抗。【关键词】罗格列酮；胰岛素抵抗；脂肪细胞；凋亡；瘦素；PPAR-γ；肿瘤坏死因子近年研究表明［1，2］，罗格列酮等可明显改

3、善高脂饮食诱导的胰岛素抵抗状态，但具体机制尚有待探讨。本研究通过对高脂饮食诱导胰岛素抵抗大鼠以罗格列酮灌胃观察脂肪组织分布、脂肪细胞因子表达及脂肪细胞凋亡的变化，以探讨罗格列酮改善胰岛素抵抗的机制。1材料与方法高脂饮食大鼠胰岛素抵抗模型的建立雄性SD大鼠24只，体重206～228g，随机分为正常对照组、高脂饮食对照组、高脂饮食罗格列酮治疗组，每只大鼠的热卡摄入为310kJ/d。正常组给予标准饲料，高脂组给予新鲜配制的高脂饲料。高脂饲料中的脂肪成分主要是熟猪油。高脂饮食罗格列酮治疗组给予罗格列酮灌胃，剂量

4、为3mg/kg，罗格列酮粉剂由史克必成有限公司提供，其余两组给予相当剂量的蒸馏水灌胃，实验周期为7周。空腹血糖、胰岛素的测定大鼠禁食8～10h后，从后眼眶静脉丛取血，血糖用葡萄糖氧化酶法测定。胰岛素以放射免疫法检测。采用北京北方生物技术研究所生产的放免试剂盒及上海核福光电仪器有限公司生产的SN-682型放射免疫计数仪测定血清胰岛素。胰岛素敏感性的测定动物空腹采血后恢复2～3天再行葡萄糖-胰岛素耐量实验测定大鼠胰岛素敏感性。大鼠于非空腹状态下，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉，行颈外静脉和股动脉插管，先从静脉注

5、射葡萄糖，随即注射普通胰岛素，从股动脉抽血用葡萄糖氧化酶法，测定实验前及注射胰岛素完毕后第3、6、9、12、15min的血糖值。胰岛素敏感性用K值表示，具体方法为：以时间为横坐标，血糖值经自然对数转化后为纵坐标，直线回归所得到的回归系数乘以-100即为K值。K值减小表示机体对胰岛素不敏感，即有IR。脂肪组织的留取葡萄糖-胰岛素耐量实验测定后，大鼠断头处死，尽可能留取同一部位股部皮下、附睾周围腹腔脂肪组织，即刻采用上海天平仪器厂生产的电子微量天平称重。称重后保存在-80℃液氮中。脂肪组织中肿瘤坏死因子、瘦

6、素、PPAR－γ基因mRNA水平的测定取附睾周围腹腔冻存的脂肪组织，用TRIzol一步法提取总RNA，经电泳显示28S、18S条带，测定OD260/OD280比值大于。应用RT-PCR法检测脂肪组织中TNF-α、leptin、PPAR－γ基因mRNA表达水平，逆转录酶、Tag酶及缓冲液购自Promega公司，PCRmarkers由华美生物工程公司提供。引物序列为：TNF-α有义链5′-AGGCGCTCCCCAAAAAGATG-3′，无义链5′-TGGCGGAGAGGAGGCTGACT-3′，扩增产物48

7、0bp；Leptin有义链5′-ACCCCAGCGAGGAAAATGTG-3′，无义链5′-GGAAGGCAAGCTGGTGAGGA-3′，扩增产物288bp；PPAR-γ有义链5′-AAGACATCCCGTTCACAAGA-3′，无义链5′-GCTGGTCGATATCACTGGAG-3′，扩增产物459bp；内参照GAPDH有义链5′-TTCATTGACCTCAACTACATG-3′，无义链5′-GTGGCAGTGATGGCATGGAC-3′，扩增产物443bp。由上海博彩生物试剂公司合成。PCR反应

8、体系为25μl，其中包括10×PCR缓冲液μl、25mmol/Lμl、10mmol/LdNTPsμl、引物μl、Taq酶μl、cDNAμl。循环参数：94℃预变性×1min，58℃退火×，72℃min，循环35次，最后7次延长至10min，4℃保存。取产物10μl用2％琼脂糖凝胶电泳，60V电泳1h，透射紫外灯下观察结果并拍照。通过电泳图像分析仪进行灰度测量，基因表达水平用TNF-α、leptin、PPAR-γ与GAPDH灰度比值表示。脂肪