流式综述—医学课件

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1、流式细胞术曹林当代生命科学热点信号传导研究技术:二维电泳,流式细胞术,免疫荧光流式细胞术流式细胞术是对单细胞定量分析和分选的新技术。激光光学检测系统信号分析。细胞从新生到死亡从细胞膜到细胞浆和核内物质及染色体，探讨不同物质之间的关系。细胞中测得多种参数(如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等)，进行多信息分析。细胞生物学和生物医学研究强而有力的手段。流式细胞仪称作荧光激活细胞分选器（FluorescenceActivatedCellSorter,FACS）能快速、精确地测量通过检测区液流中的各种粒子。这些粒子可以是细

2、胞、大分子、乳胶滴或其他粒子。特点测量速度快，最快可在1秒种内计测数万个细胞可进行多参数测量，可以对同一个细胞做有关物理(大小)、化学特性(膜电位,钙流)的多参数测量，并具有明显的统计学意义是一门综合性的高科技方法，它综合了激光技术、计算机技术、流体力学、细胞化学、图像技术等从多领域的知识和成果既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。广泛应用基础和临床医学研究，有效研究方法。它在免疫学、肿瘤学、细胞遗传学、病理学、放射生物学等学科中已形成了独立的学科分支。定量分析细胞表面和细胞内抗原，以及对细胞分子水平的核酸含量的测

3、量，这些参数的定量变化已被用于确定正常和异常细胞的分化和生长，预示各种病理状态下细胞的生物行为。发展史1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞的计数1934年Moldaven是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光电仪记录流过一根毛细管的细胞1936年Caspersson等引入显微光度术1940年Coons提出用结合了荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白1947年Guclcer运用层流和湍流原理研制烟雾微粒计数器1949年WallaceCoulter提出在悬液中计数粒子的方法的专利1950年

4、Caspersson用显微分光光度计的方法在UV和可见光光谱区检测细胞1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理成功的设计红细胞光学自动数器同年Parker和Horst描述一种全血细胞计数器装置成为流式细胞仪的雏形1954年Beirne和Hutcheon发明光电粒子计数器1959年B型Coulter计数器1965年Kamemtsky等提出两个设想一是用分光光度计定量细胞成分二是结合测量值对细胞分类1967年Kamentsky和Melamed在Moldaven的方法的基础上提出细胞分选的方法1969年

5、VanDillaFulwyler及其同事们在LosAlamosNM(即现在的NationalFlowCytometryResourceLabs)发明第一台荧光检测细胞计1972年Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞的较弱的荧光信号1975年Kohler和Milstein提出了单克隆抗体技术为细胞研究中大量的特异的免疫试剂的应用奠定了基础工作原理待测细胞被制成单细胞悬液，经特异性荧光染料染色后加入样品管中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下

6、，细胞排成单列出流动室喷嘴口，并被鞘液包绕形成细胞液柱。这种同轴流动的设计，使得样品流和鞘液流形成的流束始终保持着一种分层鞘流的状态。鞘液和样品流组成一个圆形的流束，一起自喷嘴的圆形宝石孔喷射出来，进入流动室，与水平方向的激光光束垂直相交。该区称为测量区。利用样品流和鞘流的气压差的层流原理，使细胞依次排列成单行，每个细胞以均等的时间依次通过测量区，被荧光染料染色的细胞受到强烈的激光照射后发出荧光，同时产生散射光。细胞发出的荧光信号和散射光信号，同时被荧光光电倍增管接收，被积分放大反转换为电子信号输入电子信息接收器、

7、通过计算机快速而精确地将所测数据计算出来，结合多参数分析，从而实现了细胞的定量分析。细胞仪工作示意图滤片流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。FL-3FL-2FL-1荧光信号经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或其核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的

8、各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上参数FSC物理参数SSC物理参数FL-1荧光参数FL-2荧光参数FL-3荧光参数FL-2Aarea荧光参数FL-2Wwidth荧光参数FSCSSCFSCSSC组图FSCSSCFL-1FL-3FL-1FL-1FL-1SSCFL-1SSC70.9925.2640.7558.960.9730.6649.847.7