第1单元基因工程

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1、第1单元基因工程Ø记忆网络图解551.1DNA重组技术的基本工具²核心考点背记1.1.1基因工程的概念基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基因操作水平DNA分子水平基本过程剪切→拼接→导入→表达结果人类需要的基因产物1.1.2限制性核酸内切酶一一“分子手术刀”（1）存在：主要存在于原核生物中。（2）特性：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子。（3）识别的序列的特点：呈现碱基互补对称，无论是奇数个碱基还是偶数个碱基，都可以找到一条中心轴线，如

2、图，中心轴线两侧的双链八上的碱基是反向对称重复排列的。如：以中心线为轴，两侧碱基互补对称；以为轴，两侧碱基互补对称。（4）切割后末端的种类：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端（如图所示）。当限制酶在它识别序列的中心轴线两侧将DNA55的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。切割分子时产生的两种不同末端(箭头表示酶的切割位置）特别提示①限制性核酸内切酶是一类酶而不是一种酶。②限制性核酸内切酵作用的化学键为磷酸二

3、酯键，而不是氢键。③不同种类的限制性核酸内切酶识别与切割的位点不同。这与酶的专一性是一致的。1.1.3DNA连接酶——分子缝合针种类E·coliDNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体功能特性只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来缝合两种末端，但连接平末端之间的效率较低相同点都缝合碳酸二酯键,如图:551.1.4基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（1）载体具备的条件①能在受体细胞中复制并稳定保存。②具有一个至多个限制酶切割位点，供外源DNA片段插入。③具有标记基因，供重组

4、DNA的鉴定和选择。（2）最常用的载体是质粒，它是一种裸露的、结构简单的、独立于细菌拟核DNA之外，并具有自我复制能力的双链环状DNA分子。（3）其他载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒。综合限制酶、DNA连接酶、DNA聚合酶与解旋酶种类项目限制酶DNA连接酶DNA聚合酶解旋酶作用底物DNA分子DNA分子片段脱氧核苷酸DNA分子作用部位磷酸二酯键磷酸二酯键磷酸二酯键碱基对间的氢键作用结果形成黏性末端或平末端形成重组DNA分子形成新的DNA分子形成单链DNA分子1.2基因工程的基本操作程序²核心考点背记1.2.1

5、基因工程的基本操作流程551.2.2目的基因的获取（1）从基因文库（基因组文库或cDNA文库）中获取文库类型cDNA文库基因组文库文库大小小大基因中启动子无有基因中内含子无有基因多少某种生物的部分基因某种生物的全部基因物种之间的基因交流可以部分基因可以说明基因文库的组建过程就包含基因工程的基本操作步骤。从基因文库中获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作霣大，具有一定的盲目性（2）人工合成目的基因：常用的方法有化学合成法和反转录法。化学合成法：蛋白质氨基酸序列RNA碱基序列DNA碱基序列用4种脱氧核苷酸人工

6、合成目的基因反转录法：分离出供体细胞mRNA单链DNA合成目的基因（3）利用PCR技术扩增目的基因：通过PCR（多聚酶链式反应）55可对已获取的目的基因进行扩增，在短时间内获取大量目的基因。PCR技术DNA复制过程DNA变性(90～95℃)→退火(复性55～60℃)→子链延伸(70～75℃)重复循环DNA复制起始，DNA引物生成→DNA片段生成→RNA引物水解→完整的DNA分子形成相同点原则碱基互补配对条件模板、原料(dCTP、dATP、dGTP、dTTP)、能量、酶、引物等不同点解旋方式氢键在高温下断裂、

7、双链全部解开解旋酶催化氢键逐步断裂场所体外主要在细胞核中引物DNARNA酶热稳定DNA从聚合酶(Taq酶)解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等结果在短时间内形成大量的DNA片断形成完整的DNA分子1.2.3基因表达载体的构建一基因工程的核心（1）基本过程:①用同一种限制酶分别切割载体与含目的基因的DNA分子，产生互补的黏性末端或平末端。55②用DNA连接酶将载体与目的基因“缝合”起来，形成重组DNA(基因表达载体)。③将重组DNA导入受体细胞进行增殖和筛选。（2）表达载体的组成：目的基因十启动子十终止子十标

8、记基因。①启动子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端。它是与RNA聚合酶结合的部位。②终止子：一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。作用是使转录过程停止。③标记基因：一般为抗生素基因或荧光基因等，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因(目的基闽是否导入成功)。1.2.4将目的基因导入受体细胞细胞类型常用方法受体细胞转化过程植物细胞农杆菌转化法体细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植