大肠杆菌的培养和分离

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1、微生物微生物(microorganism)结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型原生动物等等微生物的利用：抗生素；酒；腐乳；污水治理……大肠杆菌的培养与分离一、大肠杆菌（E.coli）兼性厌氧的肠道内的共生菌群合成维生素B和维生素K，供机体利用；产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和腐生菌滋生。革兰氏阴性菌作为一种工程菌，在基因工程技术中被广泛采用。例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素细菌的革兰氏染色革兰氏染色法是一种用于细菌的染色法。此法将细菌分为两类，即革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。所谓革

2、兰氏阳性菌就是用革兰氏染液染色后，再用脱色液处理，细菌仍保留染色液的颜色；革兰氏阴性菌则相反。这两种菌的差别在于细胞壁的成分不同。大肠杆菌属于革兰氏阴性菌培养基（culturemedia）按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。提供微生物生长的条件：合适的温度：25-37℃合适的pH：细菌6.5-7.5中性偏碱真菌5.0-6.0中性偏酸营养成分：含有碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。细菌喜荤，霉菌喜素培养基内所需的其他条件(1)pH值如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性(2)特殊营养物质如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加

3、维生素(3)氧气的含量如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件LB培养基的配方培养基成分各成分的量蛋白胨0.5g酵母提取物0.25gNaCl0.5gH2O加至50ml固体培养基的配制：每50ml液体培养基添加1g琼脂琼脂？红藻中提取的多糖,在98℃以上熔化，44℃以下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。凝固剂固体培养基：菌落单个或少数细菌在固体培养基上大量繁殖时，就会形成一个肉眼可见的，具有一定形态结构的子细胞群体，叫做菌落。菌落是鉴定菌种的重要依据。☆菌落液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长(三)无菌技术1、获得纯净培养物的关键:2、无菌技术的四个方

4、面(参看教材20页)3、消毒与灭菌防止外来杂菌的入侵无菌技术的四个方面（1）对实验操作空间、操作者的衣着和手进行清洁和消毒；（2）将培养器皿、接种用具和培养基等器具进行灭菌；（3）为避免周围微生物污染，实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行；（4）避免已灭菌处理的材料用具与周围物品相接触。（1）消毒：利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。消毒与灭菌（2）灭菌：灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌的过程。1)消毒：概念：使用较为温和的物理或化

5、学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢和孢子吗？方法:煮沸消毒法巴氏消毒法:如牛奶的消毒化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等紫外线消毒(不包括芽孢和孢子)（2）灭菌概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的微生物，包括芽孢和孢子。方法：a灼烧灭菌b干热灭菌c高压蒸汽灭菌灼烧灭菌微生物的接种工具(接种环、接种针)或其他金属用具直接在火焰的充分燃烧层灼烧注意适用范围干热灭菌160－170℃；1－2h能耐高温的需要保持干燥的物品(玻璃器皿)高压蒸汽灭菌100kPa121℃15-30min通常用于培养基的灭菌高压蒸汽灭菌法高压

6、蒸汽灭菌法为湿热灭菌法，其优点有三：1、湿热灭菌时菌体蛋白容易变性；2、湿热穿透力强；3、水蒸汽变成水时可放出大量热增强杀菌效果，因此，它是效果最好的灭菌方法。2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。思考1二、大肠杆菌的培养和分离实验操作（一）培养基的配置与灭菌取2个250ml的三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基和50mlLB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜，牛皮纸包装后高压锅灭

7、菌15min。LB液体培养基——细菌的扩大培养LB固体培养基——细菌的划线分离封口膜：既通气又不使菌进入（二）倒平板灭菌后的培养基在无菌操作台上倒入4个培养皿中，倒后立即置于水平位置上，轻轻晃动，使培养基铺满平皿底部，待凝，使之形成平面培养皿壁上不能沾有培养液，否则容易污染。注意事项：1.培养基灭菌后，需要冷却到60℃左右时，才能用来倒平板2.灭菌及消毒：无菌操作台用超净紫外灯和过滤风灭菌；桌面及人手用酒精棉球消毒3.操作时右手无名指和小指夹住封口膜,另外三指持三角瓶,左手拿培养皿并打开上盖的一边,在酒精灯火焰旁操作.4.需要使锥形瓶的瓶口通过火焰，

8、灼烧灭菌5.平板冷凝后，要将平板倒置,既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，