粮油检验 粮食中霉菌计数 荧光检测法-征求意见稿

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1、ICS 点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号     LS中华人民共和国粮食行业标准LS/TXXXXX—XXXX     粮油检验粮食中霉菌计数荧光检测法Inspectionofgrain－Enumerationofmoldsingrainsbyfluorescence点击此处添加与国际标准一致性程度的标识     XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施国家粮食和物资储备局   发布XX/TXXXXX—XXXX前  言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由

2、国家粮食和物资储备局提出。本标准由全国粮油标准化技术委员会（SAC/TC　270）归口。本标准附录A是规范性附录。5XX/TXXXXX—XXXX粮油检验　粮食中霉菌计数　　荧光检测法1　范围本标准规定了采用荧光检测法测定粮食及其制品中霉菌计数的术语和定义、原理、仪器和设备、培养基和试剂、操作步骤、计数和结果报告。本标准适用于谷物、豆类及其制品中霉菌计数的测定。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本

3、（包括所有的修改单）适用于本文件。GB　19489　实验室生物安全通用要求3　术语和定义3.1　霉菌计数Enumerationofmolds样品经过处理，在一定条件下培养后，所得1g检样中所含霉菌的数量。3.2　落形成单位Colony-formingunits,CFU菌一个霉菌在滤膜上生长形成可见荧光的菌落。4　原理待测样品稀释液经滤膜过滤后，霉菌被截留在滤膜上，经培养基扩增培养后再进行荧光标记，最终所有的霉菌菌落都会发出荧光。反应原理是荧光试剂中不发光的酶底物在霉菌体内参与新陈代谢时发生酶解反应，

4、底物将独立的发光基团释放到霉菌的细胞质中，当发光基团在细胞内累积后，信号自然被放大，菌落在490nm波长光线下被激发而显示荧光并被计数。5　仪器和设备5.1　电子天平：感量0.1g。5.2　荧光检测器：波长为490nm，具有自动计数功能，可人工计数修正。5.3　拍击式均质器或振荡器。5XX/TXXXXX—XXXX1.1　涡旋混合器。1.2　抽滤器。1.3　真空泵。1.4　培养箱：28℃±1℃。1.5　灭菌锅。1.6　无菌均质袋或锥形瓶（容量250mL）。1.7　广口瓶：容量500mL。1.8　试管：

5、18mm×180mm。1.9　无菌吸管：1mL。1.10　无菌微量移液器及枪头：1mL。1.11　无菌培养皿：直径90mm。1.12　无菌疏水栅格滤膜：孔径0.45mm，直径47mm。1.13　带垫片培养皿：直径50mm。2　培养基和试剂2.1　改良霉菌培养基：见附录A。2.2　无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于适量蒸馏水中，定容至1000mL后分装到试管中，每管9mL，121℃灭菌15min，备用。2.3　荧光显色液。3　操作步骤3.1　样品制备3.1.1　取样品500g用谷物粉碎机磨细至粒径小

6、于1mm（全部通过1mm孔径的试验筛），充分混匀后准确称取25g粉碎试样（精确到0.1g），加入含有225mL无菌生理盐水的锥形瓶中，盖好瓶塞，放置到振荡器中震荡30min；或放入无菌均质袋中，加入225mL无菌生理盐水，用拍击式均质器高速拍打2min，制成1:10样品稀释液。3.1.2　吸取1mL1:10样品稀释液注入含有9mL无菌生理盐水的试管中，用涡旋振荡器混匀，即为1:100稀释液。3.1.3　按7.1.2操作程序制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，更换一次无菌吸管或移液器枪头。3.

7、2　样品过滤5XX/TXXXXX—XXXX1.1.1　根据对样品污染状况的估计，选择2-3个适宜稀释度的样品稀释液进行过滤，每个稀释度分别吸取1mL注入含有9mL无菌生理盐水的试管中，用涡旋混合器混匀待滤，每个稀释度做2个重复。1.1.2　用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，将网格面向上贴放在过滤器的滤床上，按说明书要求固定好滤器，将试管中的待滤样品稀释液转移至滤器中，打开真空泵进行抽滤，抽滤完后再用10mL左右无菌生理盐水冲洗试管后倒入滤器中，打开真空泵抽滤，待试液抽滤完后再抽气约5s后关闭真空泵。1.2

8、　滤膜培养用无菌镊子夹住滤膜边缘从过滤器中取出，转移到改良霉菌培养基中，将网格面朝上，先将滤膜一边接触培养基后再缓慢下放，使二者紧密贴合，中间不能有气泡。盖好皿盖后将培养皿倒扣放入培养箱中，于28±1℃培养24±3h。1.3　菌落计数用镊子从改良霉菌培养基中取出滤膜，将网格面朝上转移到含有1.5mL荧光显色液的带垫片培养皿中，盖好皿盖后将培养皿倒扣放入培养箱中，于28±1℃培养30min，然后打开皿盖将培养皿口朝上置于紫外检测器中，按说明书操作仪器对荧光菌落计数。2