植物基因工程及应用

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1、本课程内容第一章绪论第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的载体第四章目的基因的制备第五章目的基因导入和重组子的筛选第六章外源基因的表达第七章基因操作的基本技术第八章植物基因工程及应用第九章动物基因工程及应用第十章医学基因工程及应用10/5/20211欢迎同学们听课！第八章植物基因工程及应用第一节高等植物的遗传学特性第二节高等植物基因转化第三节植物基因工程应用第四节转基因的安全性10/5/20212欢迎同学们听课！第一节高等植物的遗传学特性a.遗传操作的简易性大多数高等植物可以开花授粉，通常可产生

2、大量的后代，所以即使是非常稀有的基因突变和基因重组事件，其遗传后果也易被观察。b.整株植物的再生性植物细胞具有全能性，单个细胞可以在适当激素浓度诱导下完成脱分化、再分化的过程，分化成为叶和根，茎，最终形成整株植株。所以转化了外源基因的植物细胞可以再生形成完整的植株。c.染色体的多倍体性许多高等植物以多倍体的形式存在，大约三分之二的禾本科植物是多倍体，其染色体数目范围从24至144不等！其特征是体细胞变异频率高，在组织培养中植物细胞是遗传不稳定的。10/5/20213欢迎同学们听课！第二节高等植物

3、基因转化一.植物遗传转化的方法植物遗传转化技术可分为两大类：一类是直接基因转移技术，包括基因枪法、原生质体法、脂质体法、花粉管通道法、电激转化法、PEG介导转化方法等，其中基因枪转化法是代表。另一类是生物介导的转化方法，主要有农杆菌介导和病毒介导两种转化方法，其中农杆菌介导的转化方法操作简便、成本低、转化率高，广泛应用于双子叶植物的遗传转化。10/5/20214欢迎同学们听课！二.农杆菌介导的基因转化方法(一)农杆菌的Ti质粒与T-DNA的整合机制几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产

4、生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A.tumefaciens）。其致瘤特性是由Ti（tumor－inducing）质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulenceregion)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T－DNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链T－DNA结合，形成复合物，转化植物根部细胞。T－DNA上有三套基因，其中两套基因分别控制合成植物生长素与

5、分裂素，促使植物创伤组织10/5/20215欢迎同学们听课！10/5/20216欢迎同学们听课！Ti质粒的结构10/5/20217欢迎同学们听课！表达载体pBIn19的结构10/5/20218欢迎同学们听课！T-DNA上共有三套基因和左右两个边界，LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。　tms由两个基因组成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）　tmr由一个基因组成iptz：　tmt由若干基因构成，合成稀有氨基酸衍生物，称为opines。它有三个成

6、员：　octopine＝精氨酸与丙酮酸的缩合物　Napaline＝精氨酸与－酮戊二酸的缩合物　Agropine＝谷氨酸与二环糖的缩合物　据此可将Ti质粒分为三大类，感染的植物诱导合成这些有机碱，但不能利用它们，其分解酶基因在Ti质粒上，分解产物为氨基酸和糖类，供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。10/5/20219欢迎同学们听课！2.T-DNA的整合机制：　　T-DNA的详细整合机制尚不清楚，但有几个环节是明确的：　　T-DNA切除由Vir区编码的特异性内切酶完成，分别在LB和RB的第三

7、个碱基和第四个碱基之间产生缺口，并形成单链T-DNA。　　T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列，但整合位点的特异性尚未确定。10/5/202110欢迎同学们听课！T-DNA的整合机制10/5/202111欢迎同学们听课！(二).Ti质粒转化植物细胞的战略１.Ti质粒的改造有以下理由使天然的Ti质粒不能作为表达载体使用：　　a.生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了

8、细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。　　b.有机碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影响植物细胞生长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有机碱合成基因（tmt）　　c.Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位点。10/5/202112欢迎同学们听课！d.Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子。加入植物细胞的筛选标记，如neor基因，使用植物细胞启动子及末端polyA化信号，加入多聚