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时间:2018-09-17
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1、12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的:本试剂盒用于测定相关样本中12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)含量。实验原理:本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)水平。用纯化的12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)抗原,再与HRP标记的12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底
2、洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中12-氧-植物二烯酸还原酶(OPR)浓度。试剂盒组成:试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片(48)2片(96)密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存标准品:225ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存标准品稀释液1.5ml
3、×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存标本要求:1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融2.不能检测含NaN3的样
4、品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。操作步骤:1.标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10孔,在第一、第二孔中分别加标准品100μl,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液50μl,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取100μl分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液50μl,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl弃掉,再各取50μl分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液50ul,混匀;混匀后从第五、8第六孔中各取50μl分别加到第七、第
5、八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第七、第八孔中分别取50μl加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液50μl,混匀后从第九第十孔中各取50μl弃掉。(稀释后各孔加样量都为50μl,浓度分别为150ng/L,100ng/L,50ng/L,25ng/L,12.5ng/L)。1.加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl,然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加
6、样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。2.温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。3.配液:将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。4.洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒后弃去,如此重复5次,拍干。5.加酶:每孔加入酶标试剂50μl,空白孔除外。6.温育:操作同3。7.洗涤:操作同5。8.显色:每孔先加入显色剂A50μl,再加入显色剂B50μl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色15分钟.9.终止:每孔加终止液5
7、0μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。10.测定:以空白空调零,450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。注意事项:1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。4.请每次测定的同时做标准曲
8、线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定,计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。6.底物请避光保存。7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。9.本试剂不同批号组分不得混用。10.如与英文说明书有异,以英文说明书为准。计算:以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,8在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品
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