《抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
浙江大学博士学位论文抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究姓名：赵云鹏申请学位级别：博士专业：植物学指导教师：傅承新20060901 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘茎或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文使用授权书声明本人完全了解逝姿盘鲎有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝鎏盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：签字日期：年月日导师签名：签字日期：年月日 摘要猫人参为华东地区治疗各类消化道肿瘤的习用中草药，是目前本地区抗肿瘤处方中最多用的品种之一。目前中药学及植物学专著多记载其原植物为对萼猕猴桃(又称镊合猕猴桃)(ActinidiavalvataDunn)，但民间也有以大籽猕猴桃(以macrospermaC．ELiang)为猫人参的原植物，甚至认为后者入药疗效更佳．而且因猫人参用量较大而野生资源有限，时常有同属其它种类如黑蕊猕猴挑(丘melanandraFranch)、小叶猕猴挑“．1anceolataDunn)、中华猕猴桃(Ach／nens／sPlanch．)等混用为猫人参，影响了本品的品质和疗效．因此，当务之急首先要确定正品猫人参的原植物，并准确鉴别其与混淆品：其次猫人参的近缘种能否代用，以扩大目前严重紧缺的药源。基于此目的，本文考证了猫人参原植物，系统鉴别了猫人参及其混淆品，研究了猫人参有效部位HPLC图谱与体外抗肿瘤活性，分析比较了猫人参及其混淆品的矿质元素，确认了猫人参猫草反应的化学物质。1、原植物考证通过民间与市场调查、药材性状与原植物形态鉴定、文献查阅，根据原植物形态、药用历史和学名发表时问，明确了正品猫人参的主要来源应为大籽猕猴桃，面对萼猕猴桃可能只是其次要来源。2、种质鉴别从原植物形态、生药性状、荧光反应、紫外光谱，荧光光谱、傅立叶变换红外光谱(FLIR)．PCR—RFLP等角度系统地鉴别了大耔猕猴桃及其近缘种，尤其是形态相似而一直被认为是猫人参原植物的对萼猕猴桃。大籽猕猴桃与对萼猕猴桃等近缘种的形态差异主要在繁殖器官花果上，因此营养生长期较难鉴别．以生药性状为基础，结合9种猕猴桃生药的蒸馏水、乙醇、氯仿、石油醚提取液在254nm、365nm紫外光激发下的荧光颜色，4种提取液的紫光光谱，水提液和醇提液的荧光光谱，完全、准确鉴别了9种药用猕猴桃，编制了鉴定检索表。9种猕猴桃红外谱图总体较相似，但中华猕猴桃和毛花猕猴桃有强烈末端吸收，明显区别于其它7种猕猴桃，进一步比较大籽猕猴桃等7种猕猴桃与中华猕猴桃红外谱图的相减谱图，完全区分了9种猕猴桃，编制了鉴定检索表．限制性内切酶Ddel，DraI对大耔猕猴桃叶绿体trnK片段的酶切式样具有特异性，建立了大耔猕猴桃的PCR．RFLP分子指纹图谱，可有效鉴别猫人参混淆品的原植物． 3、体外抗肿瘤活性比较体外抗肿瘤试验结果表明，大耔猕猴桃对供试的3种肿瘤细胞株均有较强的抑制作用，但敏感性存在差异，抑制效果为肝癌SMMC-7221(IC．so=54．22／Hg／m1)>胃癌SGC-7901(133．16∥g／m1)>肺癌A549(206．63／Yg／m1)．大籽猕猴桃和对萼猕猴桃对人肝癌细胞抹SMMC-7221抑制活性差冥显著，后者(217．8599／mi)仅为前者的1／4．异色猕猴桃、长叶猕猴桃、毛花猕猴、小叶猕猴桃桃对SMMC-7221的抑制效果均显著优于大耔猕猴桃，尤其是小时猕猴桃的ICso达到6．53／zg／m!，活性相当于大籽猕猴桃的8倍，是本研究的重大发现，值得迸一步研究。在人胃癌细胞株SGC-7901、人肺癌细胞株A549试验中，9种供试材料仅大籽猕猴桃和对萼猕猴桃有一定的抑制作用，而且二者活性相当，差异不显著．基于活性分析结果，我们建议在治疗胃癌和肺癌时，大籽猕猴挑和对萼猕猴桃活性接近，均可作猫人参入药，其它种类不宜混用；而治疗肝癌时，大籽猕猴桃的活性明显高于对萼猕猴桃，对萼猕猴桃不宣作猫人参入药，或者至少须用量加倍，验证了富阳草药医认为“白货”对萼猕猴桃药效不及“红货”大耔猕猴桃，需加倍使用的说法。结合HPLC图谱和体外抗肿瘤活性结果，推测猫人参中起抗肿瘤作用的有效组分可能并不是其含量最高的几个成分，而可能是本实验条件下吸收强度较弱、分离度不佳的化合物。本试验的HPLC图谱仍需进一步改进洗脱条件，改善图谱，以更加真实地反映乙酸乙酯部位的化学成分组成。4、矿质元素分析矿质元素(包括微量元素)与有效成分是中药气味的两大物质基础，采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP-AES)测定，比较了猫人参及其混淆品和浙江地区常见的其它药用猕猴桃的矿质元素含量。目前公认的与肿瘤发生、发展有关的微量元素有Cu、Zn、sc、Fc．大籽猕猴桃Cu、zII含量显著高于其它8种猕猴桃，而Sc含量较低，Fc含量中等，说明猫人参的抗肿瘤作用还可能与高含量的Ca、Zn有关。基于矿质元素的聚类图(加大了Ca、Fc、Se、Cu的权重)表明，大籽猕猴桃与其它8种猕猴桃均有较大差异，因此从抗肿瘤微量元素含量的角度，其它种类猕猴桃代用大籽猕猴桃作猫人参似乎并不适宜。5、猫草反应研究猫人参引起人们的关注并用于临床治疗癌症，始于其对猫的特异性吸引和嚼2 食作用，本文采用GC-MS法分析了野生与组培大耔猕猴桃叶片挥发油成分，确定了大籽猕猴桃引起家猫特异性取食现象(猫草反应)的化合物为二氢荆芥内酯、二氢猕猴桃内酯及阿根廷蚁素三种化合物。这三种化合物在野生植株和人工繁殖植株中均存在，且含量相似，推测这是大耔猕猴桃的遗传性状．关键词：猫人参：大籽猕猴桃：对萼猕猴桃；生药学；FT-1R；PCR-RFLP；HPLC；抗肿瘤：矿质元素；猫草反应 ABSTRACTMao-Ren—Shen(catginseng)isoneofthemostfrequentlyusedtraditionalChinesemedicine∽M)foranti—tumortherapy,especiallyagainstCaIIcel3ofalimentarycanal，inEastChina．ItwasrecordedtObemadefromActinidiavalvataaccordingtomostTCMdictionariesandFlora．However,A．macrosperma，amorphologicallysimilarspeciestoAvalvata，hasbeenbelievedtobethegenuinereSourCeofMao—Ren—ShenandtobemoreeffectivethanA．valvatainfirstandregularlyappliedarea,basedonourfolkinvestigation．EnormousdemandsofthisTCMledtoover-exploitationofwildI'℃SOtlEOgandconfusionoforiginalplanLAdulterants,suchasA．melanandra,五lanceolata,A．chinensis，werefrequentlyobservedtobemisusedasMao—Ren·Shenresultedfromwrongidentificationandprofitablepurpose．Thequalityandcliniceffectwereseriouslyjeopardized．Thecrucialissuesare：i)WhatisthegenuineresourceofMao-·Ren··Shen；ii)howtoidentifyit；iii)whetherotherActinidiaspeciescanbeusedasit．Todealwiththesequestions，wecarriedoutaseriesofresearchesincludingoriginalplantconfirmation；morphological，chemical＆physical，andmolecularidentification；inhibitionactivityon／nvitrotumorcellline；analysisofmineralelements；analysisofessentialoil．Theresultswerc曲rainedbelow．1，ConfirmationofgenuineresourceofMao-Ren—ShenAmacrospermaWasprovedtobethemainresourceofMao—Ren·Shen．whiletheoriginallyrecordedresourceA．valvatamaybetheminorrcsonceatmost，accordingtotheresultsoffolkandmarketsurvey,identificationofplantandrawmaterial,andhistoryofmedicinalapplicationandscientificname．2．GermplasmidentificationA．macrospermawasdiscriminatedfromadulterantscomprehensivelybymethodsofmorphologyoforiginalplantandtawmaterial，fluorescentreaction，UVspectrum，fluorescencespectrum，FT-IR，andPCR—RFLP．RawmaterialofA．macrospermawascompletelyandaccuratelyidentifiedbycombinationofmorphology,fluorescentcolorsof4solventextractsexcitedby254nmand365nmUVlight．UVspectraof4solventextracts，andfluorescentspectraof2solventextracts．Adiscriminationkeywaspresentedfinally．FT-IRspectraandsubtractionspectracandistinguishraw4 matedalsofnineActinidiaspeciesrapidly．SpecificrestrictionpatternsoftrnKsequencefromA．macrospermadigestedbyDdel,DralwereobtainedbyPCR—RFLEMolecularfingerprintofA．macrospermawasestablished．3．Comparisonofinhibitionactivityom诅v／曲-otumorcelllinesTheresultsoftumorcellinhibitionindicateAmacrospermaiseffectivetothestudiedthreecelllines，butdifferinintensity：SMMC-7221(IC50=54．22／Mg／m1)>SGC-7901(133．16，Ig，IIlI)>A549(206．63pg／m1)．InassessmentofactivityonlivercancerSMMC-7721，丘callosavat．discolor,正hemsleyana，丘erianthaand五ianceolataaremoreactivethanA．macrosperma，especiallyA．1anceolatawithIC如of6．53gg／m1．about8timesthatofAmacrosperma．WithregardtostomachcancelSGG7901andlungcancerA549,丘macrosperma(IC50=133．16pg／m1．206．6399／rot)isaseffectiveasAvalvata(136．46ug／ml，224．83pg／m1),whiletheotherspecieswereineffective．Therefore,oursuggestionforapplicationofMao～Ren—Shenisthat,4．macrospermaandAvalvatacanbothbeusedasMao—Ren-Shenfortherapyofstomachandlungcancers．butAvalvataandotheradulterantsshouldnotbeusedasMao-Ren—Shenforlivercanceltreatment．Thehighactivityof五lanceolataonlivertautershouldbecoucemed．BasedonthecombinationofHPLCprofileandinhibitionactivity,itwasspeculatedthattheactivecomponentsresponsibleforthecytotoxocitymaybenottheonesthatthehighestpeaksinHPLCprofilerepresent,whiletheonesunobviouslydetected．HPLCprofilesneedtobeimprovedbymodifyelutionmethods．4．AnalysisofmineraIelementsMineralelementsaredeemedtobenefittheeffectsofTCM．aswellasbioactivefragment．MineralelementsoflawmaterialsfromnineActinidiaspecieswereanalyzedbyICP—AES．Atleastfourmineralelements，Cu，Zn，Se,Fe，arebelievedtoinhibitformationandgrowthofcancelA．macrospermaiswiththehighestcontentsofQandZn．relativelylowcontentofSe,andmiddlecontentofFe．Itindicatedthattheeffectofanti—tumorofA．macrospermamaybepartlyrelatedtohighcontentsofCuandZn．ClusteranalysiswasconductedbasedonmineraIelementsdatawithenlargedweightsofCu，zn，se，Fc．ClusterdendmgramsshowedA．macrospermawasquitedifferentfromtheothereightspecies．Therefore，fromtheangleofmineralelementsrelatedtoanti—tumor,itseemedotherActinidiaspeciesarenotsuitabletobeS usedasMao—Ren．Shen．5．ResearchORcatnipresponseMao—Ren-Shenfirstcaughtpeople'sinterestsbealllSeofitsattractiontoeaLCatspreferredeatingitsfreshleavesandtwigstoexcitethemselvesandcurewounds．Thereactionwasnamedcatnipresponse．Essentialoilsfromf佗shleavesofbothwildandregeneratedplantsofA．macrospermawereanalyzedbyGC-MS．Threecompounds，dihydronepctalactone,iridomyrrnecin,anddihydroactinidiolide,wcfedetectedinessentialoilsfromleavesofbothwildplantandartificiallyculturedplantwithsimilarcontents．Thesccompoundshavebeenrecognizedtoberesponsibleforcatnip佗sp0Irsc．KeyWords：Mao-Ren·Shen；Actinidiamacrosperma；Actinidiavalvata；Pharmacognosy；FT-IR；PCR-RFLP；HPLC；Anti·ttlmoC,Mineralelement；Catnipre$；ponse6 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究第一章研究历史与背景猫人参(对萼猕猴桃Actinidiavalvata或大耔猕猴桃彳．macrosperma)是主产我省的民问常用中草药，具有清热解毒、祛风除湿之功效，临床用于治疗深部脓肿、骨髓炎、风湿痹痛、疮疡肿毒、肝硬化黄疸腹水等，民问常用于治疗各类消化道肿瘤(江苏新医学院，1984；姚淦等，1989)．近年来发现猫人参在抑制肿瘤生长、改善生命征象方面有独特的效果(夏锦培，1997；金瑞芝和王国强，1998；来平凡和章红燕，2002)，已成为继藤梨(中华猕猴桃Achinensis)根之后的又一个来自猕猴桃属的抗癌药源，从而引起人们的关注。猕猴桃属种类众多。分布广布，我国是优势主产区(梁畴芬等，1984)。虽然美味猕猴桃作为果树进行人工栽培仅是近五、六十年的事，但猕猴桃属植物在我国药用历史悠久，历代本草均有记载。近年来学者们研究发现，该属植物具有降血脂、抗脂质过氧化、抑制肿瘤细胞、提高免疫功能等功效，因此是一类具有开发前景的药用植物。1．1猫人参的临床应用与研究猫人参，民间称痈草、猫气藤、沙梨藤。性寒，味苦。归肺、胃经。猫人参始用于20世纪60年代，当时浙江富阳市后周医院中草药医师吴宏贤先生发现此植物新鲜的茎叶能引起猫的特异性嗜食，并且在猫肢体受伤时，常嚼食该植物作自我疗伤，遂命名为猫人参．1．1．1生药学研究1．1．1．1原植物与资源据中药大辞典、植物志等记载，猫人参的原植物为对萼猕猴桃，但倪勤武和诸葛陇(1999)对浙江省的猫人参药材品种进行了调查，发现目前市售商品中，有多种猕猴桃属植物作猫人参用：(1)大籽猕猴桃，最早在富阳作猫人参药材使用的原植物即为此种，商品在当地俗称“红货”，认为最正宗，此种过去广泛分布于我省富阳、临安、杭州、桐庐、建德、嵊县、新昌、宁波、江山等地，由于多年采挖，现数量剧减，一般无商品，仅在富阳自用．主要靠江西、安徽、江苏等邻省采购。(2)对萼猕猴挑(镊合猕猴桃)，现为商品主流(俗称“白货”)，目前绝大7 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究多数文献均记载此种为猫人参原植物(中国科学院植物研究所，1972；浙江药用植物志编写组，1980)，但当地草药医认为该种不是正宗的猫人参，临床效果不及大籽猕猴桃，需加倍应用。浙江中西部、西北部有产。(3)黑蕊猕猴桃(Amelanandra)，一度混作猫人参使用，商品量也大，是否可代用尚需进一步验证．在浙西北安吉等山区收购，丽水、遂昌也产。(4)中华猕猴桃(Achinensis)和小叶猕猴桃(允lanceolata)，也有误用作猫人参现象，后者在浙江昌化一带与猫人参正品混称为“水羊桃”．猫人参目前依赖野生，采挖速度大大超过自然生长，野生大籽猕猴桃资源近于枯竭．我们实验室采用大籽猕猴桃带芽茎段成功建立了离体快繁体系，实现了其组培苗的快速繁殖(姜维梅和李风玉，2003)，并在富阳建立了繁育基地，为猫人参变野生为家种、有效保护和利用野生资源奠定了基础。1．1．1．2药用部位演变猫人参从草药演变为中药，从最初的用于治疗股骨头坏死、骨髓炎到现代临床主要用于治疗肿瘤、臌胀，尽管属于小品种，但其使用数量却逐年增加，以上海华宇药业有限公司的销售数量为例，2001—2004年猫人参的销售量分别为4、5，8、9吨(王患壮等，2005)．章红燕等(2002)统计了浙江省肿瘤医院1997．2000年中草药处方中出现次数最多的抗肿瘤药，其中猫人参均列前10名。猫人参来源于有限的野生资源，入药部位的特殊性和用量的扩大，必然产生药材的平稳供应和资源的可持续利用等方面的问题：最初采用根皮和根入药(挖根属于一次性利用，对野生资源的破坏较大)，20世纪90年代资源紧张后药用部位就扩大到根茎，并常带有部分茎枝，王忠壮等(2005)对药材收购部门、饮片生产企业、饮片经营企业及部分省市的一些药房、药店进行来源调查和样品鉴别，发现有些批次的饮片来源于茎枝，而且比例成上升趋势。L1．1．3生药学鉴别传统鉴别方法是肉眼或显微观察药材的形态特征，闻其气味，尝其味道等。如倪勤武和诸葛陇(1999)总结民间鉴别猫人参的方法是看其断面皮部是否有“亮星”(草酸钙结晶)、原植物叶片有否“猫爪印”(紫色斑)及猫是否爱吃来确定真伪；并总结了大籽猕猴桃、对萼猕猴桃、黑蕊猕猴桃、小叶猕猴桃和中华猕猴桃原植物形态和药材性状的鉴别要点。王忠壮等(2005)比较了大籽猕猴桃、对萼猕猴桃、中华猕猴桃饮片性状。但传统方法对经验依赖性较强，而且近缘物种8 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究往往具有相似的形态性状，难以截然区分。如猕猴桃属多种植物根皮均含有草酸钙结晶，大籽猕猴桃叶片上的紫色斑纹仅见于部分植株，该属多种植物的新鲜叶片均能引起猫的特异性嗜食(倪勤武和诸葛陇，1999)。因此朱妙琴和吴永江(2003)采用荧光反应法、紫外光谱法、荧光光谱法和裂解毛细管气相色谱法等现代仪器分析技术对猫人参(文中所用材科为对萼猕猴桃)以及藤梨和木天蓼(葛枣猕猴桃Apolygama)进行鉴别，结果在254nm紫外灯下，猫人参水溶液几无荧光，而其余二者均显较强荧光，3种药材提取物的紫外光谱和荧光光谱存在着明显差剐；在适当的裂解色谱条件下，3种药材显示出各自特征的裂解色谱指纹图．1．1．2临床应用有关部门根据临床资料加以整理分析，已将猫人参收录于地方药材标准(浙江省卫生厅，1994)．目前猫人参已经作为中药用于临床，用量一般为30-60g，主要以饮片入汤剂。临床上用于治疗肿瘤(食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、宫颈癌等)、肝病(乙肝、肝炎后脂肪肝、肝硬化伴腹水(鼓胀)、阻塞性黄疸)、上呼吸道感染、白带多，疮疖痈肿(王忠壮等，2005)、盆腔炎(蔡文娟，2005)，也有用单方治疗麻风病(江苏新医学院，1984)。用猫人参汤(猫人参、灵芝、柴胡、生薏仁、黄芪，清炙甘草、桃仁、红花、鳖甲、蛇舌草、石见穿)口服加榄香烯注射液注射治疗15例消化道肿瘤(食道癌3例、胃癌7例、肠癌3例、肝癌2例)，效果满意(夏锦培，1997)。由猫人参、茵陈、过路黄、石见穿、半枝莲、泽泻、车前草、郁金、延胡索、大腹皮、山楂组成的猫人参汤治疗臌胀，疗效颇佳(金瑞芝和王国强，1998)。甘利欣加用健脾化瘀汤(猫人参、白花蛇舌草、黄芪、白术、茯苓、郁金、赤芍、三七粉(吞)、丹参治疗慢性乙型肝炎及肝纤维化指标异常56例的效果显著优于单用甘利欣的54例(李炎戊和周德利，2005)．由猫人参、黄芩、柴胡、白术、刘寄奴等组成的清肝冲剂治疗127例，可明显改善慢性丙型肝炎的症状、体征(孙学华等，2003)。．国家级中医唐福安自拟基础方(绞股蓝、藤梨根、白花蛇舌草、猫人参、半边莲、薏苡仁、郁金、枳壳、生甘草)随症加减，在治疗肺癌、减轻患者症状、改善生存质量方面有较好疗好(周兆兴，2000)．蔡文娟(2005)自拟清热活血汤(银花，红藤、半枝莲、夏枯草、山慈菇、9 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴另Il及其与近缘种豹活性比较研究猫人参、蜈蚣、皂角刺、穿山甲、乳香、没药)内服加灌肠治疗盆腔炎90例，治愈率88．9％、显效率94．4％、有效率97．8％。石膏、生地、知母、猫人参、朱砂根、生马钱子、天葵子．白花蛇舌草、七叶一支花等组成的药方可用于治疗慢性白血病(叶风，2005)1．1-3化学成分与药理作用1．1．3．1化学成分猫人参化学成分的报道尚较少见。仅我们实验室报道了猫人参的无机元素(陆胤等，2004)和氨基酸分析(冯懿挺等，2004)。1．13．2药理作用张亚妮(2005)对猫人参醇提物进行了分离及抗肿瘤活性试验，其蒽醌和皂苷部位对体外8种不同组织来源的肿瘤细胞株都有一定的抑制作用，且作用具有剂量依赖性，其中对人白血病细胞株K靳2的作用最强，IC钿分别达到20．80、39．31／Ⅱg／ml。肿瘤细胞大多处于S期，Go／Gl期次之，G2／M最少，猫人参蒽醌和皂苷两部位使GdGl期、S期的细胞数下降，而G2／M期的细胞数大大上升，同时细胞凋亡比例也有所上升，表明二者是通过影响细胞周期及诱导凋亡发挥其杀伤细胞作用。动物实验结果表明，蒽醌和皂苷部位在100mg／kg时抑瘤率可达50％以上．而从体重变化、一般情况的观察及肝脏病理切片看，其毒副作用小，生存质量较高。万旭英等(2004a)研究了单味猫人参注射液在体外对肝癌细胞的抑制作用，结果显示猫人参注射液对人肝癌细胞株SMMC-7721、小鼠肝癌细胞株H22，大鼠肝癌细胞株CBRH一791的ICso分别为107．70、519．49、667．56mg／ml。用猫人参注射液100、50、25g／kg连续尾静脉注射lO天后，对d、鼠皮下移植性1422肝癌的抑瘤率分别为62．16％、35．14％、17．13％，有较明显的剂量依赖性，其中剂量为100g／kg时抗肿瘤作用较理想，可延长腹水型肝癌小鼠的生存期，且对细胞免疫功能无抑制作用(万旭英等，2004b)。由生白术、川椒目、葶苈子、猫人参等中药组成的悬饮宁方有抑制人肺腺癌细胞SPC2A21浸润的作用，还可改变S180腹水瘤小鼠排列疏松的腹膜问皮细胞，从而控制腹水瘤小鼠癌性积液生长(徐振晔等，2005)．1．2猕猴桃属植物化学研究 博士学位论文：抗肿癌中草药箍人参的种质鉴别及其与近续种的活性比较研究1．2．1猕猴桃属简介1．2．1．1分类历史1836年，英国植物分类学家JohnLindley在描述记载Wallich1821年在尼泊尔采集的一份硬齿猕猴桃C4．callosa)标本时建立了猕猴桃属(Actinidia)。1911年，S．T．Dunn首次对猕猴桃属植物逶行了系统的分类学研究，将该属分为4缀24种约16交种．近50年李惠林(1952，1976)、梁畴芬(1982，1984)、崔致学(1990)陆续对该属进行了修订。据我们统计，目前猕猴桃属共有74种，约120个变种、变壁，其中中国产70种，另有4种产国外，分剐是尼泊尔猕猴桃(／LstrigosaHook．￡&Thorns．)产尼泊尔、锡金，沙巴猕猴桃U．petelotiiDiels)产越南，山梨猕猴桃(Arufa(sieb．etZucc．)Planch．cxMiq．)、白背叶猕猴桃(AhypoleucaNal@i)产日本(黄宏文，2000；李瑞高等，2002，2003；邓德由和闵天禄，2003)．目前猕猴祧属下分类多采用梁畴芬(1983，1984)的4组4系系统：净果组(Sect．Leiocarpae，包括片髓系Set．Lamellatae、实髓系Set．Solidae)、斑果组(Sect．Maculatae)、糙毛组(Sect．Slrigosae)、星毛组(Sect．Stellatae，包括完全星毛系ScLPerfectae、不完全星毛系Set．1mper[ectae)。但由于猕猴桃属植物天然杂交率高，杂交起源的种类多，种问性状的镶嵌分布比例也很高，从而造成组问和种问界限不明显，如斑果组植物中含有净果组和星毛组植物的毛被类型。因此越来越多的证据对梁畴芬4组4系分类系统提出了质疑，认为该系统没有很好地反映猕猴桃属的系统发育。虽然猕猴桃属内的分类争议较多，但是目前形态学(梁畴芬等，1984：何子灿等，2000；李建强等，2000)，时片黄酮(Webbyetal，1994)、等位酶(TestolinandFerguson,1997)、PCR—RFLP(Cipdanictal，1998)、RAPD(图1．1)(Huangclal，2002)等多数证据较好地支持净果组为单系类群。1．2．1．2生物学特性猕猴桃是功能性雌雄异株(functionallydioecious)植物，即雌株的花从结构上看虽是完全花，但雄蕊败育不产生有生活力的花粉：而雄栋的花则雌蕊败育不形成胚珠。花瓣颜色多样，有白、黄，青绿、黄绿、金黄、粉红、深红等，花药有淡黄、绿黄、橙黄、金黄、褐黄、黄、褐、暗褐、紫黑、黑等颜色(李瑞高等，1996)。该属植物果实大小从最小的海棠猕猴桃(Amaloides)单果重仅O．69，到最大的美味猕猴桃(一．deliciosa)可高达2409．形状圆形．椭圆形一长圆柱各异。 博士学位论文：抗胂擂中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究果皮颜色褐一绿一黄．橘黄一红．紫红等。果实毛被从密被棕色长硬毛的刺毛猕猴桃(彳．setosa)到光滑无毛韵软枣猕猴桃呈现广泛的连续变异。果肉颜色绿．翠绿—橘黄．紫红。风昧从涩、麻不堪入口的葛枣猕猴桃、大籽猕猴桃、对萼猕猴桃到酸甜适度的中华猕猴桃、美味猕猴桃、软枣猕猴桃(正argUta)等(黄宏文等，2000)．0．20of3t札‘ZFi亭I-IUPGMA—的哪gn_嘛ed埘thesimilarityU麓c--哇’seoefllcfemt)nmtriⅡcalculatedfromRAID血细of40,40En／d／ahxlThe由tlcdlinesLidlcamthelwocm-offpoints,DI=0．52andD!=032．Numbersonthepheaogramlabelabe取憎眦iofclu蛐：mCopheneticcorrel越ioacoe．衄1cielmlis0．76．LEi：Sect．Le／ocarpaELain：S％hⅧ岫S0l：‰$o／／dae；MAC：SectMaculatae；,弧Seo．．Sn'igosae；,滩SecLStellotae；kSet．PerfectaclnI弘5er．Imperfectae．(HuⅫgelat,2002)1．2．1．3药用历史中药大辞典(江苏新医学院，1984)共记载了6种药用猕猴桃：①软枣猕猴桃：②紫果猕猴桃c4．argutavat．purpurea)；③葛枣猕猴桃；④对萼猕猴桃；⑤毛花猕猴桃；⑥中华猕猴桃。’刘贤铭和王铁僧(2000)通过调查整理，介绍了江浙闽地区9种l变种药用猕猴桃：①软枣猕猴桃，果实供药用，有强壮、解热收敛功效；②葛枣猕猴桃，根、12 博士学位论文：抗肿癌中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究果实供药用．有理气止痛的功效：③对萼猕猴桃，根药用，有清热解毒、消肿散疖的功效，临床及民阃用于消化道肿瘤；④大耔猕猴桃，根药用，有清热解毒、消肿的功效；⑤异色猕猴桃“．callosavaLdiscolor)，果实供药用，有强壮、解热收敛的功效；⑥阔叶猕猴挑(丘taafolia)，根供药用，治腰痛、筋骨痛、疮疥，茎叶有消肿酌功效；⑦小叶猕猴桃，根供药用，有活血补精的功效，可治筋骨酸痛等症；@毛花猕猴桃，根、叶供药用，有清热解毒、舒筋活血的功效，民间用于食道癌，有缓解病情的作用，叶治痈疽、肿毒、乳痈，多用作外敷；⑨中华猕猴桃，根、茎、叶供药用，有利尿解毒、活血消炎、化湿散结的功效，民间及箍床常用于治疗消化道肿瘤，有滋补强壮作用；⑩长叶猕猴桃(Ahemsleyana)根供药用，有清热解毒的功效。1．2．2猕猴桃属化学成分研究前人已研究了猕猴桃属多种植物不同部位的化学成分，分离得到多塘、生物碱、皂苷、有机酸等化合物。1．2．2．1多糖多糖是猕猴桃属植物最早受关注的化学成分之一，其免疫、药理实验结果显示了一定的生物活性，也是目前猕猴桃类保健食品、药品的研发热点．多糖大多溶于水，所以常用水热提取乙醇沉淀。石钺等(1993)利用水提醇沉的方法从软枣猕猴桃茎中分离到三种B．杂多搪：AAPSIfD一木糖：L-阿拉伯糖：D．甘露糖：D一葡萄蓿：D一半乳糖：未知糖x1(2．80：1．79：0．28：1：2．09：1．84)J、AAPSIIID·木耱：L．阿拉伯糖：D．甘露糖：D一葡萄搪：未知糖x1(6．03：5．20：0．46：1：7．03)l、AAPSⅢ【D．木糖：D．葡萄糖：D．半乳糖：未知糖xl(8．19：1：0．47：10．8)1。阎家麒等(1995)从中华猕猴桃根中分离到中华猕猴桃多糖(AcPS)。祝晨藤(1998)从革叶猕猴桃(月．rubricaulisvat．coriacea(Fin．ctGagn．)CELiang)果实中分离得到平均分子量为106,000的单一多塘，其组成为D一葡萄塘：D．甘露糖：D．木糖：D一半乳塘：L-阿拉伯糖(1．07：0．77：0．28：0．33：1．01)．但是有的糖类溶于有机溶剂。如狗枣猕猴桃(爿．kolomikta)根依次经95％乙醇、氯仿一乙醇(2：1)提取后，再经氯仿．甲醇(100：70)洗脱得到2，3．二．o一6．D．半乳糖基．a．D．半乳糖(狗枣三糖)结晶(李平亚等，1992)；狗枣猕猴桃叶依次经70％乙醇和正丁醇提取后，再经氯仿．甲醇(2：1)洗脱得到二糖麦芽糖(常晓丽等，1996)。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究1．2．2．2生物碱猕猴桃碱(actinidine)是一类不常见的单萜生物碱．其基本骨架是3．氮杂双环【4．3．O】王烷(图1-2)，毗啶环可不同程度氢化，c4、G、C6、c7上常带有一OH、-CHj、．COOCH；、-CHO等基团．该类天然产物的存在形式以单体为主，也有二聚体，具旋光，多为固体，少呈液体。沸点lO阻103℃。由于该生物碱对猫科动物有兴奋作用，且是某些昆虫防御性分泌物的主要成分，因此受到了研究者的重视(陈巧鸿，2000：Chietal，1992)．1959年Sakanctal首次从葛枣猕猴桃中分离到f-)-actinidine。随后从软枣猕猴桃中也分离到猕猴桃碱(Grossctai，1972)．1．2．2．3皂苷皂苷在猕猴桃属植物中的含量普遍较高，尤其是三萜化合物。其中，齐墩果酸(oleanolicadd)类(图1-3)和乌苏酸(ursolicacid)类(图1．4)衍生物因具有较高的药理活性和广泛存在性而为人们所重视。到目前为止，已经先后从软枣猕猴桃的叶(石钺等。1992；1993：1994)、茎(赵恒等，1994)和根(金永日等，1998)，毛花猕猴桃的茎(自素平，1997a)、根(黄初开等，1986；黄初升等，1988；黄初升等，1992；白素平，1997b)，中越猕猴桃(彳．indochinensisMerr．)的根(覃益民等，1999)中分离出2种齐墩果酸衍生物和9种乌苏酸衍生物。固1-2嚣猴枕碱(actinidioe)圈1-3齐墩果酸(ok墙nolicacid)图I_4乌苏酸(urselkacid)引自陈巧鸿(2eeo)引白Lie(1，95)引自Liu(1995)1．2．2．4挥发油除挥发性猕猴桃碱外，人们还鉴定和分离了其它挥发油成分。从狗枣猕猴桃叶片挥发油中鉴定出21个组分，主要化学成分是乙酸戊酯(21．1％)和4．甲氧基丁酸甲酯(16．8％)；从软枣猕猴桃叶片挥发油中鉴定出16个组分，主要化学成分是4．甲氧基丁酸甲酯(93．51％)(常晓丽等，1991)．王玉敏等(1994)对狗枣猕猴桃茎部挥发油进行研究，鉴定出十六酸、十六碳二烯酸甲酯、十二酸三种主要成分，分别占总挥发油含量的32．13％、30．17％和23．2％。Matichetal(2003)对软枣猕猴桃的花及果实的挥发油进行研究，从中分离出六、七十种不同的化合14 博士学位论文：抗肿窟中草药猫人参的种质鉴别及其与近绦种的活性比较研究物，花的挥发油主要包含芳樟醇类化合物如lilacaldehydes、alcohols、2,6-dimethyl-6-hydroxyoCta02,7-dienal、8-hydroxylinalooi和scsquiteq'cncs；而从果实中提取出一些单萜化合物，但占主导地位的仍是酯类如ethylbutanoate、exauoatc、2-methylbutanoate、2-methylpropanoate、aldehydeshexanal和hex{!khal。1．2．2．5其它除了以上几种化合物以外，还从草叶猕猴桃，狗枣猕猴桃和软枣猕猴桃中陆续发现了咖啡酸、3，4----羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、蒲公英醇、谷甾醇、胡萝p苷(祝晨蕨，1997；自素平，1997a)，琥珀酸、中肌醇(常晓丽等，1996)，10一十一碳烯酸辛酯及正二十二烷(王宝珍等，1996)，毛花猕猴桃酸(金永日等，1998)．Hirschetal(2002)从美味猕猴桃和中华猕猴桃中鉴定出两种香豆素一一白蜡树苷(fraxin)和马栗树皮苷(esculin)，但在其它一些猕猴桃属植物，如硬齿猕猴桃臼．callosa)、毛花猕猴桃、长叶猕猴桃(Ahemsleyana)、软枣猕猴桃、狗枣猕猴桃、黑藐猕猴桃及葛枣猕猴桃中却不含有这两种化合物。1．2．3猕猴桃属药理研究近年来，众多学者对猕猴桃属植物各部位提取物的药理活性进行了研究，发现其具有降血脂、抗脂质过氧化、清除活性氧自由基、抑制肿瘤细胞，提高免疫功能等方面的药理活性．1．2．3．1猕猴桃果实的药理活性(1)降血脂作用何素琴和曹兴亚(1999)实验证明，猕猴桃果汁不仅可降低血脂，还可增加高密度脂蛋白．胆固醇(HDL-CH)，认为猕猴桃果汁对高脂血症、动脉硬化、心脑血管病防治有实用价值。进一步的动物实验表明，猕猴桃果汁可明显降低高胆固醇血症小鼠血清中总胆固醇含量，提高高密度脂蛋白胆固醇含量．(2)抗突变作用猕猴桃果汁能显著抑翎环磷酰胺(cyclphosphamide，CP)引起的大鼠外周血双核淋巴细胞微核细胞率的升高(李双莲等，1998a)。进一步研究发现猕猴桃汁有可能通过诱导机体生物转化II相酶活性，从而促进CP的代谢灭活而抑制其遗传毒作用(李双莲等，1998b)．(3)抗氧化作用中华猕猴桃果汁可显著降低肝脏脂质过氧化物水平、超氧 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性(张书芳和王培席，1996)．中华猕猴桃原汁对H202所致溶血的抑制活性高于维生素C(唐筑灵和张小蕾，1995)。葛枣猕猴桃果汁在饲喂小鼠20天后，提高了小鼠血液及脑、肝、心、肺组织中超氧化物歧化酶(SOD)的活性，同时能够降低脂质过氧化物(LPO)的含量，其对脑组织的作用最显著(张兰杰和袁勤生，1997)。’(4)增强免疫功能’林延鹏和王琦(2000)实验表明服用SOD猕猴桃果汁后，红细胞与血清丙二醛(MDA)含量显著降低；免疫球蛋白IgG、IgA、IgM均呈上升趋势，lgG与lgM上升尤为明显。(5)抗肿瘤作用李延(2001)报道，美味猕猴桃提取物对小鼠S180的抑制率达41．4％，有良好抗肿瘤作用；而中华猕猴桃提取物抑制率在30％以下，无明显抗肿瘤作用。1．2．3．2猕猴桃根及根部提取物的药理活性中医认为，猕猴桃根具有清热、利尿、活血、消肿、治肝炎、水肿，跌打损伤，风湿性关节痛，淋浊、疱疖和抗癌作用(邹益友和谭桂山，1999)。其狠的提取物具有清除活性氧自由基和抑制肿瘤细胞等作用。(1)清除活性氧自由基中华猕猴桃根中提取的中华猕猴桃多糖(ACPS)对二甲基亚砜碱性体系产生的0；k的清除能力与SOD相当，对Fenton反应产生的OH·的清除能力略高于vc'且清除能力与ACPS的浓度成正比，表明ACPS具有与机体内源性抗自由基体系相类似的作用能力(阎家麒等，1995)。(2)抗突变作用吴阿富和王伟郎(1999)用猫人参的60％乙醇提取物迸行抗Trp-P．1致突变活性的研究，发现其抗Trp．P．1致突变活性达80％以上．实验中观察到提取物质DMSO的有色试液中加入Trp．P．1时，有的出现颜色改变，因此，推论这种抗突变作用可能是因为Trp-P．1与试样中某一种或几种组分发生了化学反应，破坏了原试液某些化合物的呈色结构，而Trp-P．1本身可能转化生成另外一种失去了致突变性的新化合物造成的。近年来，发现乌苏酸(猕猴桃中广泛含有的一种皂苷)能对抗致癌物质如苯骈芘、黄曲霉素Bl诱发的基因突变，并能使诱变剂丝裂霉素C诱导产生的小核多色红细胞(MPCE)少760(I．iut1995)。(3)抑制肿瘤细胞邹益友和谭桂山(1999)在中华猕猴桃根水提液中，用乙酸乙酯萃取其中中等极性的有效成分(主要是蒽醌类化合物)，用噻唑蓝比色 博士学位论文：抗肿瘟中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究法(thinzolyblueterazoliumbromide，~frr法)其抑瘤作用，结果显示，其对自血病细胞的抑制率为54．24％，对结肠低分化腺癌细胞抑制率为60．01％，提示猕猴桃根中提取的复合液对肿瘤细胞的DNA合成和诱导T4淋巴细胞产生1I-．-2，促进天然杀伤细胞对YAC-1淋巴细胞的毒作用，从而杀伤肿瘤细胞。总之，猕猴桃根提取物蒽醌类化合物对肿瘤细胞有明显的杀伤作用。1．2．3．3猕猴桃多糖的药理活性猕猴桃多糖以其简便的提取工艺及较强的生理活性，引起人们的极大关注．它是一种有效的免疫调节剂，而且具有很强的抗细菌感染的免疫作用及抗肿瘤作用．(1)抑制肿瘤细胞侯芳玉等(1995a)发现软枣猕猴桃多糖可显著提高鼠伤寒杆菌感染的小鼠生存率，抑制小鼠S180实体癌的增殖，其机理可能与软枣猕猴桃多糖能增强机体的免疫功能有关。(2)抗病毒作用邵传森和林佩芳(1991)用两种方法检测了中华猕猴桃多塘对轮状病毒的抑制作用．结果发现，细胞先感染轮状病毒后加多糖则对病毒有抑制作用，而先用此多糖处理的细胞后感染病毒，但不能保护细胞免受感染。由于猕猴桃多糖的抗轮状病毒感染作用及其低毒性，研究者预测其有可能成为一种有效的抗病毒药物。(3)免疫调节功能张菊明和林佩芳(1990)研究了中华猕猴桃多塘复合物对小鼠免疫系统的调节作用。结果证明：①可明显促进天然杀伤细胞对YAc—l淋巴癌细胞的细胞毒作用：②能加强巨噬细胞的吞噬功能：③能明显增强特异花结形成细胞(sRFc)数，但对抗体形成细胞(PFC)无任何影响；④能有效地回复被环磷酰胺抑制了的迟发超敏(DTH)反应．同时证明本品具有很强的抗细菌感染的免疫作用。因此，可以认为猕猴桃多糖是一种有效的免疫调节剂。软枣猕猴桃茎多糖AAPS在体内和体外都可促进小鼠T、B淋巴细胞的分裂增殖：显著增强吞噬细胞的吞噬功能；明显促进ILl、IL-2的产生；增强小鼠B细胞对胸腺依赖性抗原的初次抗体应答(侯芳玉等，1995b)。1．2．3A猕猴桃碱的生物活性药理研究表明，猕猴桃碱对猫科动物中枢神经有特异的影响。使动物流涎、凝视、舔物、打滚、陶醉，并表示敌意、睡眠等(Tuckeretal，1988)。该类生物碱能增强苯巴比妥的镇静和催眠作用，对正常未孕大鼠，其可缩短动情期的休止 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究期，延长动情期和动情后，摘除卵巢和脑垂体后，上述机能的影响不复出现，表明该类生物碱并无性激素样作用，而是通过脑垂体实现对性机能的影确。分离自克拉克荆芥(Nepetac缸rkei)中的猕猴桃碱对产真菌毒素的真菌(AspergillusIra．s，Aspergillusochraceus,PeniciUiumcitrinum，Penicilliumviridicaturn)和大豆潜伏病原真菌(Sclerotiumrol／sff’Macrophominaphaseolina)的抑制活性均高于阳性对照，其中对胍phaseolinai的活性最高(Saxenaetal，1996)．猕猴桃碱是多种竹节虫防御性分泌物的主要成分(HoandChow,1993)；在猛蚊(Megaponerafoetens)中作为警报信息素(alarmpheromone)(Janssenetal。1995)；在隐翅虫的分泌物中也有(Kanehisaetal,1994)．分离自竹节虫的猕猴桃碱具有熏蒸性杀虫剂的潜力(Bouchardctal，1997)．1．3现代分析技术在生药鉴定中的应用随着中药现代化步伐的加快，中药的标准化已成为中药产业发展和打入国际市场的瓶颈。药用植物或植物药的发展离不开标准化生产，即目前大力推行的GAP(GoodAgriculturalPractice，中药材生产质量管理规范)工作的核心。而种质和品质的标准及科学的鉴定方法是质量标准控制和管理的前提，对药材种源的鉴定和标记是解决中草药种植上品种混乱问题和检验原材料市场上存在的品质优劣的基础。常用的药用植物种源遗传分析、品种科学鉴定和标记方法在形态分析基础上，已发展出现代仪器分析鉴定技术和DNA分子标记技术。1．3．1现代仪器分析技术在生药鉴定中的应用中药往往是由众多化学组分所组成的复杂物质体系，药材的生物多样性和药材生产和制作过程参数的波动均会引起药品化学组成的变化，传统的测定一个或几个“指标成分”含量的方法无法对中药质量作出整体分析，从而形成药物分析学科的一大难题。传统的理化鉴定多以寻找特征峰为目的，近年来随着化学计量学的发展，人们试图发展化学指纹图谱分析技术用于综合评价天然产物质量(覃洁萍等，2004)。化学指纹图谱分析在传统理化鉴别获取指纹图谱的基础上，再对运用计算分析技术对所获得的谱图数据进行处理，通过筛选和简化，获得专属、宏观、整体的化学特征综合信息，并对样品化学组成的总体波动情况进行估测。常用的检测方法有气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、高效逆流色谱18 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究(HSCCC)，高效毛细管电泳(HPCE)、紫外光谱(uv)、红外光谱(IR)，X．射线衍射图谱、核磁共振波谱(NMR)、质谱(Ms)等，其中HPLC、lR更为多用．．1．3．1．I高效液相色谱法HPLC具有较高的分离能力，随着检测器灵敏度、种类的增加，其适用范围越来越广，已成为最有前途的一种分析方法(梁鑫淼和徐青，2003；springfeildetal，2ID06)．Lauetal(2004)建立了三七(Panaxnotoginseng)生品和炮制品(水蒸气熏蒸)的HPLC指纹图谱，可相互区别二者．王丽霞等(2006)用多台阶梯度洗脱的反相高效液相色谱法，建立了秦岭山区产3种淫羊藿药材的由9种成分组成的色谱指纹图谱。刘梅等(2003)以延胡索乙素和原阿片碱(延胡索丙素)对照品为参照，应用HPLC指纹图谱鉴别夏天无(紫堇cdecumbens的干燥块茎)与延胡索药材的异同，发现二者在共有峰数目、位置、相对峰面积，特征峰数目、位置、相对面积、总峰相对面积等存在一定差异。李玉峰等(2006)采用高效液相色谱法测定了11种贝母(Fritillariaspp．)样品，根据样品中不同化学组分的保留时间、相对峰面积，应用化学计量学方法计算出描述相邻两个色谱蜂分离程度和质量的重要参数并进行聚类，聚类分析的结果与其植物学分类相一致。张戈等(2006)采用HPLC法对分布于我国11个省份的红花(Carthamustinctorius)药材(共36份样品)进行色谱分离，使用“中药指纹图谱工作站”进行数据处理，对不同种质红花药材进行聚类分析，并对其相似度进行分析，结果来自我国11个省份的不同种质红花药材可以聚为两类，生长于西北地区的红花品种之间相似度较高；生长于中部、南部地区的红花品种之问相似度较高。ZouetaI(2005)采用RP-HPLC和层级聚类分析法建立了不同产地板蓝根(1satisindigotica)的指纹图谱．张克荣等(2004)通过用HPLC方法建立白芍的指纹图谱，并将聚类分析和相似度分析的数据分析技术应用于白芍的指纹图谱，以夹角余弦、相关系数和欧氏距离作为测度，分别计算各样品的相似度．采用3种不同测度的相似度检验白芍的指纹图谱，趋势是一致的，得到了3种不同测度之间的相互认证。用该法分析未知样品时，只需测得该样品的色谱指纹图谱，计算未知样品与共有模式问的相似度，即可对样品进行鉴定，分类和评价．1．3．1．2红外光谱法19 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究红外光谱的指纹性目前已逐步成为共识。纯化合物的分子振动光谱反映了分子内部存在的各种基团具有指纹特性的振动。对于一个混合物体系。其分子振动光谱的峰形、峰位，峰强代表着体系中所含各种相应基团的谱峰的叠加。混合物组成的变化，将直接导致分子振动光谱整体谱图的变化，但仍能保持其谱图的宏观指纹性。利用这种宏观指纹性，结合一些模式识别技术或计算机辅助解析方法，如导数谱、二维相关红外光谱(2D—IR)、人工神经网络以及阵列相关比对软件等，可用于中药的品种、产地及采收时间的鉴定与质量控制。红外光谱法对被测试样的状态无苛求，气态、液态和固态皆可。因此在大多数情况下，对试样的测量可以做到不失原本性，无损性。简便、快捷，对试样只作物理粉碎压片等简单的处理，无需繁琐的提取分离过程即可直接测试．而且可以利用公认的、药效稳定的药材、成药壹接进行标准化，丽不必专门寻求单个的、纯的标准物。常用红外光谱法有傅立时变换红外光谱(FI：IR)、傅立叶变换拉曼光谱(FF-Raman)、浸反射傅立叶变换红外光谱(DR—FTlR)、漫反射傅立叶变换近红外光谱(DR．NIR)、HATR．FIrlR等。孙素琴等(2003b)对中药的红外指纹图谱进行了系列研究，共测试了280种对照药材、20种伪品药材、4种不同产地的药材、400多种中药配方颗粒(其中包括同一厂家不同批次的配方颗粒)和20多种不同厂家生产的中药注射剂，共计2000多张红外光谱、二级导数谱和几百张二维相关红外谱，结合化学计量学方法对谱图进行了分析。实验表明，差异较大的不同种中药仅用一般的红外谱图就可以简单做出判定，差异较小的不同种中药材(包括不同产地的中药材)采用红外谱图和二级导数谱图相结合作为判定的依据铰为合适，红外谱图和二级导数差异较小时则可凭借二维相关红外光谱判定，三种方法联用可有效鉴定主要成份和区别不同样品(Lietal，2004；Yuelal，2005；Liuetal，2006)。红外指纹图谱可应用于中药材及其制剂的真伪鉴定、野生和栽培药材的聚类分析和识别、药材品种的分类与鉴定、判定辅料的用量、制药工艺的稳定性检查等。红外光谱法发展的新趋势是结合化学计量学用于药材鉴别。如胡钢壳等(2005)以含不同川贝母和浙贝母比例的41个样本建立校正集，采集其近红外漫反射光谱数据，通过偏最小二乘法进行回归，经内部交叉验证，建立校正模型，进而对预测集样品进行分析，结果表明应用近红外漫反射光谱技术和化学计量学方法快速检测川贝母中浙贝母掺入量效果令人满意。采用Fr-IR结合化学计量学 博士学位论文；抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究主成分分析(PCA)、遗传算法(GA)、线形辨别分析(IDA)、SIMCA等多变量分析方法，鉴别了不同产地的小余甘子(Phyllanthusniruri)(Dharmarajetai，2006)。1．3．1．3其它技术质谱法用于中药指纹图谱的研究也有报道，且以与HPI．C或GC联用更常用。韩风梅等(2006)应用电喷雾离子阱质谱(ESI-MS)技术研究丹参酮类成分的ESI-MS规律，其图谱可用于丹参药材及复方丹参中丹参酮类成分的快速鉴别．刘荣霞等(2005)在建立降香(Dalbergiaodorifer)药材液相色谱指纹图谱的基础上，采用HPLC-DAD—MS技术对其主要成分进行定性分析，分别在3类药材中指认了10个、7个和2个酚性成分。魏刚(2005)在石菖蒲、广藿香等研究的基础上。探讨了GC-MS建立中药特征指纹图谱色谱条件韵参数设置，结果升温程序、电离电压、柱前压与流速等对特征指纹图谱的影响较大，丽离子源温度、迸样口温度的影响较小；并认为GC-MS建立中药特征指纹图谱方法先进、可靠，并建议采用特征指标成分群开展方法学(精密度、稳定性、重现性)的考察，且将相对含量的RSD值定为不得大于5％。高效逆流色谱是新发展的一种色谱指纹图谱技术．Guctai(2004a；20lMb)比较了HSCCC与HPLC、NACE(non-aqueouscapillaryelectrophoresis)对不同产地丹参(Salviamiltiorrhiza)租提液的分离效果，结果表明HSCCC法的分离效果高于其它2种方法，且保留时间的相对偏差(RSD)小于3％，达到国家中药指纹图谱的耩确度要求。吴云山等(2002)采用粉末X射线衍射Fourier谱签定法，通过对5种白芍药材进行分析，获得了白芍的标准x射线衍射Fourier图谱及特征标记峰值。1．3．2DNA分子标记技术在药用植物鉴别中的应用自上个世纪90年代发明用RAPD(RandomAmplifiedPolymo叩hicDNA，随机引物扩增多态性DNA)(包括AP．PCR、DAF)用于种质遗传分析以来(Braunnerctal1992)，DNA分子标记的研究和应用技术取得了快速的发展．已发展了ISSR(InterSimpleSequenceRepeat，锚定的简单序列重复)、RFLP(RestrictionFragmentLengthPolymofphism，限制性片段长度多态性)、AFLP(AmplifiedFragmentLengthPolymorphism，扩增片段长度多态性)、SNP(SingleNucleotidePolymorphism，单核营酸多态性)、PCR-cpDNA或mtDNA的序列多态性分拆和2l 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究SCARs(SequenceCharacterizedAmplifiedRegions，特征序列扩增片段)等多种标记方法，近年来已逐渐应用于药材道地性鉴定及近缘生药和易混淆生药的鉴定，取得了较大进展，并显示了良好前景(曹晖和刘玉萍，1998；李晓波等，2002；Gongetal-2006)。1．3．2．1RAPDCheungetal(1994)首次报道了采用A_P．PCR标记鉴别中药材人参与西洋参，他们采用20bp的Galk，Seq2，24bp的MBforward、MB[CVerSe和27bp的OTCSbackward作引物成功地利用AP．PCR指纹图谱技术鉴定了人参和西洋参。RAPD法具有快速、简便、灵敏度高等特点，在中药鉴定中的应用较多(Fuctal,2000)，但RAPD法的重复性差问题曾引起许多争议(刘春林等，1999)，汪小全等(1996)采用大量对照实验，并结合他入的研究成果，对RAPD技术作出了。可以应用于种闻乃至近缘属之间亲缘关系的研究，但有一定的局限性”的结论．RAPD不仅在原植物鉴定中应用广泛，在成品药材和干燥药材的鉴别中也有报道。Ozekietal(1996)采用GI℃(异硫氰酸氨)微量提取法提取DNA进行RAPD分析，结果显示人参组培物制作的泡茶与愈伤组织具有相同的指纹图。张荣等(1996)采用RAPD技术对铁线莲属7种8个生药样品进行了鉴别，这为解决粉末及破碎药材的鉴定提供了新方法。RAPD的引物为lObp的寡核苷酸片段，AP-PCR(随机引物PCR)、DAF(DNA扩增指纹)的引物长度分别为20或30bp、5或8bp，三者本质上都是任意引物的随机扩增，只是所用引物的长度不同而已(邹喻萍等，2001)。1．3．2．2RFLP。RFLP分析是用一组限制性内切酶对基因组或某基因片段迸行消化，再电泳分离、染色后观察限制性片段式样的多样性。早期的RFLP分析是对整个cpDNA基因组进行消化，并需傲Southern杂交，PCR技术发明后，大大降低了模板DNA的量，并可选用不同引物扩增不同片段，从而促进了PCR—RFLP技术应用的迅速发展。该技术基本是在本世纪初才开始应用于药用植物鉴定，效果显著。Mizukamietal(1996)用RFLP技术对苍术(Atractylodeszoncea)、白术“．ovata)、关白术(Ajaponica)的rDNA进行研究，发现SacI酶切图谱差异明显，能准确区分这3种植物。Nganctal<1999)采用PCR—RFLP方法考察了5．8SrDNA转录内间隔区(internaltranscribedspacer，ITS)，成功区分了人参属6种植物及其 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究2种易混伪品。Fu等(1999)采用PCR—RFLP分析了rDNAITS区，鉴别了4种药用党参：党参(Codonopsispilosula)、川党参(Ctangshen)、素花党参(Cmodesta)、大花党参(cnervosavat．macrantha)及其2种掺杂品：土党参(Campanumoeayavanica)、桔梗(Platycodongrandiflorus)。张婷等(2005)采用PCR，RFLP法，扩增rDNAITS区用分别用Clal和ApaLI、Sphl酶切，有效鉴别了束花石斛(Dendrobiumchrysanthum)、流苏石斛(D．fimbriatum)及其形态相似种的原植物．对rDNAITS区的PCR．RFLP分析结果可以准确区分伊贝母(Frititlariapallidiflora)及同属的8种贝母(Wangetai．2005)．NdeI、TaqI对5S．rRNA非转录间隔区(NTS，non．transcribedspacer)的酶切图谱有效区分了Salviadivinorum及其混淆品鼠尾草(Sofficinalis)(Berteaclal，2006)．桃几七(Sinopodophyllumhexandrum)trnD4rnT片段的Hinfl、Ddel酶切图谱可区掰与八角莲属植物(Dysosmaspp．)，另外发现引物对A49291和B48557扩增的桃儿七和八角莲trnT4rnL片段存在显著的长度差异，可直接区别两类植物(Gong烈al。2006)。13．2．3AFLPAFLP是1993年Zabeau&Vos发展的一种新的DNA指纹技术，它是RFLP与RAPD楣结合的一种分子标记技术，既具有RFLP标记的专一性、可靠性，又具有RAFD标记的随机性、方便性，因此被称为“最有力的分子标记”或。下一代分子标记”(Hansenetal，1999；林忠平等，2000)。罗志勇等(2000)从人参、西洋参的干燥根中提取基因组DNA，运用AFLP技术。成功地构建出多态性丰富和重复性好的人参、西洋参AFLP图谱，发现西洋参与引种到我国吉林的西洋参的基因组DNA发生了一定的变异，但变异程度小于人参与西洋参问的差异。马小军等(2000)对人参5种农家类型的AFLP图谱进行研究，所有类型均有特异条带可作为鉴别特征。虞泓等(2004)利用AFLP技术对石斛属内石斛组4个种和1个外类群种进行基因组DNA多态性分析，5对引物组合构建了5个种AFLP图谱，聚类分析结果证明该图谱可以用于药用石斛种的正确鉴定．杜娟等(2006)利用AFLP技术鉴别了全国10个主要产地的野生或栽培半夏。另外，AFLP技术还成功鉴别了4种古柯(ErythroxylumcocavaLcoca、EcocavaL枷如、￡novogranatensevat．novogranatense、Enovogranatensevat．truxillense)(Johnsonetal，2003)、3种香茶菜(Plectranthusgrandis、卫 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究barbatus、Pornatus)(Passinho．Soaresctal，2006)。1．3．2．3DNA序列分析DNA序列分析用于中草药鉴别可靠性最高，对遗传信息的考查更直观。而且测序可咀对混和样品进行分析，克服了其它方法不能鉴定复方制剂和掺假粉末状药材的缺点，近年来应用较多．同时，其缺点也较为明显：对该物种序列信息需要有一定的了解：测序仪和相关试剂价格昂贵：单个基因多态性有限等。目前．用于中草药鉴剐的基因包括植物叶绿体基因组的rbcL、matK、rpoC等、植物核基因组的rDNA、ITS等，这些基因进化速率都较快，但一些区段保守性又较强。Lau等(2001)分析了16种石斛属植物的rDNA的序列，在ITS2区种问差异为12A％。而与非兰科植物和伪品之间的差异分别为29．8％和18．8％，因此ITS2区序列完全可以作为鉴定石斛药材的依据。曾明等(2003)分析了葛属植物野葛、粉葛和山葛3种4个样本的rDNAITS序列，野葛与粉葛的ITSl，1TS2的差异性分别在2．10％和2明％以内，而山葛与野葛、粉葛在ITSI、ITS2的差异性则分别达到8．14％和12．82％以上，表明ITS序列特征是中药葛根鉴别的有效分子标记。王淑美等(2004)通过对16个牛膝样品rDNA序列分析可知，不同产地牛膝基因变异不大，种间有明显差异。且差异均在ITS区内，如川牛膝ITSI有差异、土牛膝ITSI及ITS2均有差异，说明ITS区易变异，此方法可用于牛膝种问及真伪品鉴别。Tsoi等(2003)克隆和测定了9种贝母的26SrDNA的D2与D3区的多态性片段序列，根据结果设计了DNA芯片对各种贝母进行监测，能够准确区分各种，表明DNA芯片技术可能会给中草药鉴定提供一个高通量的检测工具。Caoetal(2001)测定了来自中国和日本的6种姜黄属药材18SrRNA及trnK基因序列，18SrRNA序列长度均为1810bp，其中广西莪术存在1个碱基的变异，而tmK基因各种之问均存在替换、缺失和重复序列，由此，trnK基因序列可作为鉴定这6种姜黄属植物的依据。Yangetal(2001)测定和分析了大黄属13种26个居群49个样本的trnL／-trnF间隔区的序列，找出了大黄属植物该段序列的变异特征，根据分析结果设计了大黄特异性引物用于鉴别大黄，结果理想，为该领域做了有益的尝试．曹晖等(2001)对三七及4种伪品的18SrRNA和marK序列进行了测序，正品与各种伪品序列均存在明显差异。秦民坚等(2003)测定了射干以及鸢尾科2种代用品和2种伪品共5种植物rbcL序列，分析发现存在 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究多个突变位点，而种内居群间碱基序列差异明显小于种间差异，可以很好鉴别5种植物．Tomarietai(2002)分析了rps基因retl6～rpll4间隔区的核苷酸序列，获得了能够区分正品肉苁蓉核和2种混淆品的DNA片断．Kojomaetal(2002)对肉桂、锡兰肉桂、阴香和清化桂进行测序分析，发现在叶绿体trnL-trnF外显子间隔区和trnL内含子区分别有1个和3个变异位点可将4种药材正确分开，可用于鉴别正品肉桂。1．4本文的研究目的与研究内容1．4．1研究目的虽然猕猴桃属植物资源与植物化学研究取得了巨大进展，但其药用研究相对于其丰富的资源来说仍远远不够。就猫人参这种浙江地区习用的抗肿瘤中草药而言，有几个问题迫切需要解决：(1)猫人参的原植物究竟是哪一种?目前几乎所有记载猫人参的植物学和中药学专著都认为其原植物是对萼猕猴桃，但实际应用中猫人参又有“红货”的大耔猕猴桃和“白货”的对萼猕猴桃之分，本地草药医认为前者更正宗。(2)如何鉴别猫人参及其混淆品?目前实际应用中猫人参常用品有大耔猕猴桃、对萼猕猴桃、黑蕊猕猴桃、中华猕猴桃、小叶猕猴桃等，严重影响了猫人参的品质和疗效，迫切需要从原植物形态、生药性状、理化分析、分子生物学鉴定等角度系统地鉴别正宗猫人参及其形态相似种类，以保证药材种类的正确性和临床使用的有效性。(3)猕猴桃属其它种类能否代用猫人参原植物?富阳草药医认为，“红货”的大籽猕猴桃最正宗，疗效最佳，而。自货”对萼猕猴桃需加倍使用才能达到同等疗效，至于其它猕猴桃则是猫人参的假品，不予采用。因此，需要从有效成分和药理活性上提供科学依据，判断对萼猕猴桃能否代用大耔猕猴桃，同属的其它种类是否具有类似的疗效，以扩大猫人参的药源，更好地满足市场需求。这些问题是我国中药应用和中药现代化过程中的共性问题，其有效解决无疑具有较高的理论价值和经济效益，也正是本研究的主要目的所在。1．4．2研究内容基于上述目的，本文的研究内容包括：(1)通过民间调查、市场考查、野外活体标本采集与鉴定、植物园种植观察、标本室蜡叶标本鉴定、猕猴桃学名考察，考证并确定正宗猫人参的原植物。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究(2)采用原植物形态比较、生药性状观察、荧光反应法、紫外光谱法(uV)、荧光光谱法、傅立叶交换红外光谱法(FT-IR)、限制性片段长度多态性(PCR．RFIJP)等形态、性状、理化、分子鉴定方法系统、全面地鉴别猫人参及其混淆品和浙江地区常见的其它药用猕猴桃，提出最优的鉴定方法和技术体系．(2)采用高效液相色谱法(HPLC)分析猫入参及其它药用猕猴桃有效部位的图谱，同时以卤虫(Artemiasalina)和体外肝癌细胞SMMC．7221、胃癌细胞SGC-7901、肺癌细胞A549为模型，分析有效部位的抗肿瘤活性，并推测其它种类的药用猕猴桃能否代用猫入参，以及猫人参的有效部位，以指导进一步的有效物质(群)分离．(3)矿质元素(包括微量元素)与有效成分是中药气味的两大物质基础。采用电感耦合等离子体原子发射光谱法(ICP—AES)测定、比较猛人参及其混淆品和浙江地区常见的其它药用猕猴桃的矿质元素含量，从微量元素角度探讨猫人参抗癌疗效的化学基础，并为猫人参生药质量控制和人工种植指导提供依据．(4)猫人参最早引起入们的注意，源自其新鲜叶片对猫的特异性吸引作用，但该反应的化学机制尚未见报道，因此拟对野生和组培猫人参的叶片挥发油成分进行分析、比较，以确定猫人参引起猫特异性嚼食作用的化学物质。 博士学位论文=抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究第二章猫人参原植物考证及其与近缘种的生药学鉴别猫人参是浙江地区习用中草药，民问常用于治疗各类消化道肿瘤(姚淦等，1989)，是目前抗肿瘤处方中最常用的中草药之一(章红燕等，2002)．猫人参的原植物较为复杂，尚未有定论。目前几乎所有记载猫人参的植物学和中药学工具书如中国高等植物图鉴(中国科学院植物研究所，1972)、浙江药用植物志(浙江药用植物志编写组，1980)、中药大辞典(江苏新医学院，1984)，都记载其原植物为对萼猕猴桃(镊合猕猴桃，Avalvata)，但实际应用中猫人参有“白货”的对萼猕猴桃和“红货”的大籽猕猴桃(Amacrosperma)之分，本地草药医认为后者更正宗，前者使用量需加倍才能达到后者相同疗效．倪勤武和诸葛陇(1999)对浙江省猫人参药材品种进行了调查，发现目前市售商品的原植物除对萼猕猴桃和大籽猕猴桃外，还有黑蕊猕猴桃(Amelanandra)一度混作猫人参使用，商品量也大：中华猕猴桃(Achinensis)和小叶猕猴桃(丘lanceolata)也有误用作猫人参现象．我们在药材市场调查和购买猫人参商品与野生品比较时，也发现市售猫人参所谓正品绝大部分是对萼猕猴桃，大籽猕猴桃较少且以富阳当地医院自用为主，而且混用现象严重，常有黑蕊猕猴桃、小叶猕猴桃、中华猕猴桃被收购作猫人参。因此，考证、确定猫人参的原植物，并鉴别其形态相似种和近缘种以保证种源纯正和用药质量就显得十分必要。目前，市售猫人参药材几乎全依赖野生资源的采挖，猫人参初步显示的抗肿瘤效果使其生药用量迅速增加，使大籽猕猴桃的野生资源急剧下降，不能有效满足市场需求。因此，由于历史原因和经济利益驱使，猫人参生药的混用现象十分严重，倪勤武和诸葛陇(1999)的报道和我们的调查均证实了这一点。国内外关于猕猴桃生药的鉴别报道较少。翟延君等(1993)报道了软枣猕猴桃根的生药鉴定及其与中华猕猴桃的区别，倪勤武和诸葛陇(1999)总结了大耔猕猴桃，对萼猕猴桃、黑蕊猕猴桃、小叶猕猴桃和中华猕猴桃的药材性状，朱妙琴和吴永江(2003)采用荧光试验法、紫外光谱法、荧光光谱法和裂解毛细管气相色谱法鉴别了对萼猕猴桃、中华猕猴桃、葛枣猕猴桃，但是远未达到准确鉴别种类众多的猕猴桃属植物生药材的效果。因此，准确鉴别猫人参正品及其混用品和浙江地区常见的药用猕猴桃生药，以保证药材质量和疗效即是本研究的另一目的所在．本研究旨在通过民间与市场调查、活体标本与蜡叶标本鉴定、文献考证等方法，考 博士学位论文：抗肿癌中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究证猫人参的原植物，并提供猫人参原植物与其形态相似种和近缘种的形态区别：采用性状观察法、荧光分析法、紫外光谱法、荧光光谱法，以准确鉴别猫人参及其混淆品的茎干生药材。2．1材料与方法2．1．1材料供试材料为2003乏004年秋冬季(10～11月)采集于各地的9种猕猴桃直径约2cnl的成熟茎干(见表2-1)，并将部分植株移栽于浙江大学植物园供进一步试验。凭证标本存放于浙江大学植物标本馆(HZU)．表2．I供试材辩1批2．1I工矗●fstndⅫ咐tert_b2．1．2方法2．1．2．1原植物考证：采用常规方法，即民间调查、市场考察、野外活体标本采集与鉴定、植物园种植观察、标本室蜡叶标本鉴定及查阅学名发表时问。2．1．2．2性状观察：每种猕猴桃随机选择5个正常茎段，通过肉眼及解剖镜观察其形态。茎干在中药粉碎机中粉碎2mm，观察粉碎物的颜色和形态．2．1．23荧光反应法：精确称量4份粉末，2．00∥份，分别加蒸馏水、无水乙醇、氯仿、石油各20ml，密封，55℃水浴2h，不时振荡，过滤，滤液分别在254、365nm紫外灯下10锄处观察荧光颜色。2．1．2A紫外光谱法：上述4种滤液作相应稀释后，以相应溶剂为对照，测量紫 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究外吸收光谱。仪器：UV-1600紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，扫描范围200-400nm，狭缝1nm，扫描速率20nm／min，取样问隔1nm，室温18℃．2．1．2．5荧光光谱法：精确称量2份粉末，0．10g，份，分别加重蒸水、无水乙醇各10mI，密封，55℃水浴2h，不时振荡，过滤，取滤液进行荧光光谱扫描。仪器：HITACHIF-4500FL荧光分光光度计，Flour方式，激发波长扫描范围200-700nm，选择激发蜂的最大波长作为激发波长，扫描发射波长．扫描速度1200nm／min，狭缝2．5nm，扫描步长5nm，室温15℃所用试剂均为分析纯。2．2结果与讨论2．2．1．猫人参原植物的考证及形态鉴别．2．2．1．1猫人参原植物的考证猫人参的药用历史较短，始用于20世纪60年代，当时浙江富阳市后周医院中草药医师吴宏贤先生发现此植物的新鲜茎叶能引起猫的特异性嗜食，并且在猫肢体受伤时，常嚼食该植物作自我疗伤，遂命名为猫人参，并作为草药开始用于治疗骨髓炎等症。因其显著的抗肿瘤疗效，近年来猫人参开始进入中医药方，逐步发展为中药。目前中草医认为，猫人参的正品是对萼猕猴桃或大耔猕猴桃，浙江地区尤其富阳三山医院、吴氏肿瘤医院等则认为“红货”大籽猕猴桃比“白货”对萼猕猴桃药效更佳、更正宗。目前市场上猫人参的来源有大籽猕猴桃、对萼猕猴桃、黑蕊猕猴桃、中华猕猴桃、小叶猕猴桃等。但根据前人的报道和我们的调查，黑蕊猕猴桃、中华猕猴桃、小叶猕猴桃等均是在野生资源不足或经济利益驱动下混用为猫人参，属伪品。在野外考察中，富阳当地药农所采的“红货”和“自货”猫人参原植物，经我们形态学鉴定，分别为大耔猕猴桃和对萼猕猴桃。另外，经查阅‘中国植物志》猕猴桃科(梁畴芬，1984)，对萼猕猴桃的学名是S工Dunn1911年发表，大耔猕猴桃的学名是梁畴芬1984年在编写‘中国植物志》猕猴桃科时发表，而猫人参是20世纪60年命名．即猫人参始用时，只有对萼猕猴桃的名称，尚无大籽猕猴桃的称呼，而事实上当时对萼猕猴桃的表现型包括了韧皮部较白和韧皮部偏红的两种类型，而后一种类型即是富阳当地中草医认为更正宗的、后来被植物分类学家命名为大籽猕猴桃。因此，从物种学名的发表时问和中草药的始用时问进一 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究步证实了富阳中草医认为更正宗的“红货”大籽猕猴桃是猫人参的原植物。因此，大籽猕猴桃应是猫人参的主要来源，丽中药大辞典等记载的猫人参原植物对萼猕猴桃可能只是其次要来源．2．2．1．2猫人参原植物及其近缘种的形态学鉴别大籽猕猴桃及其近缘种的形态观察见图2-1、2-2。大耔猕猴桃隶属猕猴桃属净果组(Sect．Leiocarpae)实髓系(Set．Solidae)，与同组同系的对萼猕猴桃和葛枣猕猴桃形态上颇相似，尤其营养生长期的成熟植株与对萼猕猴桃较难区分，而黑蕊猕猴桃、小叶猕猴桃、中华猕猴桃等混用为猫人参的伪品以及浙江省常见的近缘猕猴桃种类与大耔猕猴桃则相对较易区别，经蜡叶标本与活体植物观察，做鉴别检索表如下：1．植物体无毛，或叶腹面散生糙伏毛，背面叶脉上有毛或仅脉腋处有髯毛．2．果实无斑点，项端有喙或无喙：叶片干后腹面不变黑褐色．3．茎髓片层状，白色或淡褐色；萼片和花瓣均5枚．4．叶片椭圆形或长椭圆形，边缘具内弯的锯齿，背面被白粉⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯黑蕊猕猴桃4．叶片阔卵形或圆形．边缘具细锐锯齿，齿失常不内弯，下面不具白粉⋯⋯紫果猕猴桃3．茎髓部实o，偶见片层状，白色：萼片2-5枚；花瓣5．1撒．5．花瓣5枚；萼片通常5枚：叶腹面散生短糙毛或无毛⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯葛枣彝族桃5．花瓣5一12枚；萼片2．3枚；叶腹面无短糙毛6．叶片两面无毛或叶脉上疏生软刺毛；萼片3枚，偶见2枚；花瓣5-9老t；果卵球形或长圆状圆柱形，顶端有尖喙：种子叫小，横径约1．8nun⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯对萼裤猴桃6．叶片两面无毛或背面脉腋常有髯毛，中脉或叶柄上常有短小软刺；萼片2-3枚；花瓣5．12枚；果圆球形，顶端的喙不明显；种子较大，横径约3mm⋯⋯⋯⋯大耔嚣猴桃2．果实有斑点，顶端无喙：叶片两面无毛，干后腹面黑褐色。背面灰黄色⋯⋯异色裤猴桃1．植物体显著被毛．7．植物体被不分枝的硬毛或刚毛⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～长叶猕获桃7．植物体被柔毛或柔毛；叶背面被分歧的星状毛．8．叶片较小，长3．5—10cin，宽24cnl，背面被极短的灰白色或灰褐色星状毛⋯～⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯～小叶称襞桃&叶片较大，长6-15cln，宽4-10Ⅷ，叶背面被较长的星状毛9．星状毛白色，稀灰黄色；花紫红或淡红色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一毛花称获桃9．星状毛灰褐色或黄褐色；花白色一淡黄色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯中华貅穰桃 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究圈2．1大耔猕猴横(1-4)与对萼猕猴执(s-8)Fig．2．-1A．macro删a(1^4)ndA．"^∞(s_田3l 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究图2-2大籽猕猴桃的几种常见近缘种(1t葛枣猕猴拂。2：黑蕊猕猴桃，3．紫果猕猴桃；4l异色猕猴桃，＆长叶猕猴桃，‘；毛花猕猴桃，7；小叶猕猴桃，8{中华猕猴桃)Fig．2-2Sevenrelatedspeeimof^macrosperman：^po／ygmm珥2：^melamandra,3：^argutavlropurpure峨4：^删tHo．cavlr．discolor,5．^缸啊觚鲫蚺焉6：^打细咖珥7．^／aceo／,血,0：^di嗍f研 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究由上述分种检索表可见，大籽猕猴桃与对萼猕猴桃的区别主要在繁殖器官，而营养生长期二者形态上十分相似。图2-1为大籽猕猴桃和对萼猕猴桃叶、花、果实、幼苗的形态观察。根据我们的野外考察和栽培试验，总结几点营养生长期的鉴别经验如下(表2-2)．表2-2大耔猕猴槐与对萼棼猴撬营养生长期鉴别要点Table2-2KeydH用Kk脚afordiscrimination硝^mwzrmpermaaadA．州呐劬duringvegelatioap枷2．2．2生药性状观察大籽猕猴桃及其近缘种茎干生药材形态解剖学观察见图2-3，结果与倪勤武和诸葛陇(1999)的报道基本一致。9种猕猴桃生药材的横切面上可见明显木射线和导管，在许多种类中孔径较大的导管往往排列成同心环状(图2．3)：草酸钙针晶分布较普遍，多数种类韧皮部的针晶数量多于木质部，不同种类问针晶的数量和长度存在一定差异，大籽猕猴桃的针晶最多、最长，对萼猕猴桃与之相似，毛花猕猴桃的结晶较少见，其它种类差异不显著。不同猕猴桃树皮的颜色和剥落方式有较大差异(表2—3)，1(大籽猕猴桃)、2(对萼猕猴桃)、4(紫果猕猴桃)是小片状剥落，3(黑蕊猕猴桃)的树皮为大片状剥落，而6(长叶猕猴桃)、7(毛花猕猴桃)、8(小叶猕猴桃)、9(中华猕猴桃)的树皮一般不剥落；树皮颜色则从淡褐色到褐色和紫褐色均有．9种猕猴桃茎干粉碎物的基本颜色为黄褐色，但不同种颜色深浅有所差异；粉碎物形态基本以粉末和碎屑为主，但不同种类粉碎物的纤维化程度有较大差异，黑蕊猕猴桃粉碎物纤维化程度最高，而毛花猕猴桃最低。然而猕猴桃的某些形态特征具有连续性，如大籽猕猴桃、对萼猕猴桃、异色猕猴桃的茎干髓部一般为实心，但是也有个别呈片层状；长叶猕猴桃、中华猕猴桃的树皮大多不剥落，但也有小片状剥落的。商用生药材切成饮片后，外皮特征 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究常常丢失。这些原因往往导致仅凭形态特征难以准确鉴定药用猕猴桃种类。图2．3生药横切面(1t大籽猕猴桃，2：大耔猕猴桃(示草酸钙针晶)；3t对萼猕猴桃；如黑蕊猕猴拂；5I小叶猕猴桃；b中华猕猴挑)Fig2-31h-|ver”sectionofrawmaterials(1：At．macrosperma；2：工uacrospel懈a(indicatecrystals)；3：^ra／pam；4．^me／anandra；5：^／anceo／ata；‘．^曲细m黼 *弈+鼙譬霉．司寝越*宾+霹嚣IlI．固晕饔*舞+乓肇1肆篓篓虫．毋霉饔*豁+娶肇毒等鬈虫．司寝嚣*察+嬖话辱．锄率餮轻拦籍嶝器拦器陛格借长豁+霹譬并嚣士葶．嗣霉轻世*窭强黾+霹蟹等磐士摹．$晕鏊*霉+餐警．o军塔田晕．榷磊等卷÷。馋嚣毒函军装．壤幕峙寸霉臻．转嚣vN∞霉．鼙l霹葵蒜÷。蛙幂醑函霉鬈．键蓄葵蜒、f，鞋《*十媳聋墨肇趟犀．暗参唔蠡曾孙媳铎霸鞋《*，箍趟器．f《辎．曙扛《*牛媳警趟犀．咯客譬餐*，鞋封幂锄察．耱磊嚣叠；弗艟桀鼋．怠群．瞎每-甘生莹稚剖E十硝日霉．壤磊嚣鸳*肇遐*十蚺曾鞋谜器．喀蠡8卑f；箨恬隶．K第姑《．娘嚣旨粤墨笔暮豢．壤簿第据畚．、『，搿嚣霉．怠鞘拯．X馨卑露．铺越釜．X鞯柱霉．铺第毽乏．书霉篓避“^．田霉嚣篓{荸f兰．9丑嚣趟{『．羽霉嚣暴黛稿葶哥口嚣黛舔吾÷∞墨整藏嚣御h茸馨蒸毒必u埘接．、『，锑嚣《辐攀Lf簿5～”‘曰晕餐荤黛舔司咪¨爿拄，『，鞯嚣幕．铺算趟tIf．9轻餐。寸丑嚣糕舔=l|}第；寸越拯．-Y酃鼯幕氟．篓翠}f。一渊聪嚣。锄F=I茸搽舔壤睦n供髻々母}田丑譬趟器．田霉鬈举冀嚣毒长*簧硝．黎哥年器。o霉袈．壤幕篓}f、『，怠譬茸藕蓝鼙．喀车々篁÷一．<察．埘痞．峨琏毒缸暮5．袜．口丑嚣搽蒋黔苌Ⅳ氍墨奄七b十田嚣捌肇毯器．羽蒜鍪肇餐**媳逢簿々匡争N餐警摊嚣1圭0：o茎；氯5a：：：．．萎垂芝星搽‰鹱筘搬鞋醵貔蚕雅骥熬P末戆骣翘羹器型未琶蒙。丑荤羹妻．鲁奄}odJo￡暑_o墨善苦Iou艺-暑。芒-蕾i茜分u；器；暑写霉葛兰∞．oz抬{lf婶m骚嚣被蜜弘诔堪畚咯5荨缸砷嚣是*露中鹰薯一釜-毫专弋喾lu|oH暑．葛Jo嚣Il|t鲁lo暑4专ltq—go；看甘olI暑鼍oIoIIaJo至n‘!五JI．镰鼷葵掣扑幂譬伯避舞马罡捌牛堋嚣嫠蒋露ac-一群茧誊帮兰荦蜒g霹赣鞫耳暑铽暴酵堪毒g嘏<据垒薹*}嬖耋S．烈犁犁井÷彗 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质签刹及其与近缘种的活性比较研究2．2．3荧光反应9种猕猴桃4种溶剂提取液的荧光反应见表2-4。由表可知，大籽猕猴桃4种提取液在254nm激发波长下均无荧光，在365nm激发波长下仅水提液和氯仿提取液有荧光，但颜色与其它种类多类似．对萼猕猴桃的4种提取液在两种激发波长下均有荧光、中华猕猴桃水提液的荧光为淡蓝绿色至蓝绿色、长叶猕猴桃的醇提液在365nm激发波长下发射紫色荧光，显著区别于其它种类。其它种类的荧光颜色亦有不同程度的差异，但是3(黑蕊猕猴桃)和8(小叶猕猴桃)的4种提取液在两个激发波长下均无可见荧光。本文结果与朱妙琴和吴永江(2003)关于对萼猕猴桃和中华猕猴桃根的水提液254nm下荧光反应的报道基本相符，但荧光强度略有差异。365nm荧光试验法是《中国药典》规定的药材鉴定方法，本文增加了254nm波长的检测，虽然荧光反应明显少于365nm，但在药材种类较多时能补充一定的鉴别信息。供试猕猴桃的石油醚提取液几乎全部没有荧光反应，这与其极性小而致提取物少有关，因此该溶剂在荧光试验中不宜采用。表2-4，种猕髌枕4种提取液的荧光反应Table2-4FluorescenlrElcIIJOlae14solventextrads打ⅢmimeA,毹mM／aspeci52．2．4紫外光谱法9种猕猴桃的4种溶剂提取液的紫外吸收光谱见图2．和2．7。由图可见，9种猕猴桃的紫外光谱较相似，但3(黑蕊猕猴桃)、5(异色猕猴桃)，6(长叶猕猴桃)、8(小叶猕猴桃)、9(中华猕猴桃)的水提液有强吸收峰(IXA>0．09)，且6，8的峰值大于0．7(图2．4)；1(大籽猕猴桃)、3(黑蕊猕猴桃)、5(异色猕猴桃)、6(长时猕猴桃)、8(小叶猕猴桃)、9(中华猕猴桃)的醇提液有强吸收峰(AA>o．06) 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的话性比较研究(图2-5)；1(大籽猕猴桃)、2(对萼猕猴桃)、3(黑蕊猕猴桃)、5(异色猕猴桃)、9(中华猕猴桃)的氯仿提取液有较强吸收峰(AA>0．03)(图2-6)：8(小叶猕猴桃)、9(中华猕猴桃)的石油醚提取液在286-290Elm处还有一弱吸收峰(图2．7)．然而，综合4种提取液的紫外光谱仍难以区分3(黑蕊猕猴桃)和5(异色猕猴桃)、4(紫果猕猴桃)和7(毛花猕猴桃)。本文结果表明，对萼猕猴桃茎干无水乙醇提取液并无末端吸收，但在269-275Elm范围内有吸收强度为0．“的肩峰，而朱妙琴和吴永江(2003)报道对萼猕猴桃95％酒精提取液的紫外吸收光谱只在200111111左右出现末端吸收，其余波段无明显吸收峰(朱妙琴和吴永江，2003)，该差异可能是猕猴桃不同部位的化学成分不同或酒精浓度不同所致。本文中华猕猴桃醇提液的最大紫外吸收波长280Elm与朱妙琴和吴永江(2003)的报道完全一致，只是吸收强度略高，这可能与不同批次生药同一化学成分含量的差异有关。田2_4'种猕猴桃重蒸水提取液(稀释32倍)的紫外暖收光谱(1：大耔猕猴枕，2：对萼裤猴桃，3：墨蕊猕猴撬．4：紫果猕猴槐；5．异色猕猴桃．‘．长叶猝猴横。7：毛花裤猴撬．s：小叶猕猴执．’：中华猕蒹枕)f龟／．4I，v即edaof埘H归“‘r，cIsatnine．4a缸／d／aspecies柚Uutionx32)(1：^a,蚯arosperma,2：^M蛔籼3：^me妇ndnt,t^删p血住LpⅢ弘l，自‘5：^伪胁掘垤Ld／seo／or,‘．^缸硼幽，彻％7：丘打缸帆8：■．缸H埘Dk魄，：丘cldne．sis) 博士学位论文：抗肿信中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究圈2-5'种旃猴执无水乙醇提取藏(稀释12S倍)的紫外吸收光谱(1_，见固Z-4)Fi92-5UVspectraotelthumlextractsofnineA椭SpeCkS(d∞miou×128")‘N“1-9sHFig．¨'图2．‘，种猕猴桃氯仿提取藏(稀释8倍)的紫井吸收光谱(1．-9见图2-4)Fi924Uvspcdrldchloroformex'U-ac=ls矗-i琳^嘲妇印妇(dhthx研帆1-9雠啦卅 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究圈2-79种猕猴桃石油醚提取液的紫外吸收光谱(1-9见图2-1)Fi92-7IJVst"ctraofpetroltlmethtnrextractsofnineAct／n／击a叩ec妇(Nml-9m晦2钟2．2．5荧光光谱法通过激发波长扫描显示水提液和醇提液的最佳激发波长分别为324nnl、304哪，从而确定发射波长扫描范围分别为340-700nm、320-700nm。9种猕猴桃水提液和醇提液的荧光光谱见图2一弘2—9。由图可以看出，7(毛花猕猴桃)、9(中华猕猴桃)的水提液分别在454．4niT／、469．6Rill处有相对强度为12．00、16．82的极强峰：l(大籽猕猴桃)在645Rill处的峰强(4．693)显著高于其它种类。6(长叶猕猴桃)、7(毛花猕猴桃)、9(中华猕猴桃)的醇提液有3个峰，但三者的峰形和峰强差别较大；其它种类只有2个峰，相对强度有所差异。但是综合水提液和醇提液的荧光光谱仍无法鉴别3(黑蕊猕猴桃)、4(紫果猕猴桃)、8(小叶猕猴桃)。本文供试的9种猕猴桃2种提取液的荧光光谱均有2与个峰，由于提取溶剂、激发波长、供试部位均不同，与朱妙琴和吴永江(2003)的结果差异较大。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究mⅫ4；OOMum)Ⅻm600l㈣m圈2-8'种餮猴槐重蒸承挺取液的荧光光谱(1：大耔猕簇槐，2；对萼猕猴牲，3：要蕊猕猴执，4．紫果猕猴挑：5：异色猕猴挑，‘．长叶棼联槐。7=毛花猕猴执，s：小叶猕簇撬，'．中华裤髌槐)Fi92-8H∞n5。mt5Pcctnof棚H20extractsofnineActiuJdi．ispec；H(1：^mao-o．spom鹄2：正mfm晦3：^删妇删l函鸭t^arsufnvar．purpurea,s．^coUosaVRF．幽啪虹‘．^7,cmsl廿a,zo,7．A耐哪^qS：^lanceo知rta,，：At．曲如口睹I囝2-9'种裤猴撬无水乙醇提取液的荧光光谱(1-'见图2-8)r唔2-9FluorescentspecterofethsnoJextractsornlneAdtmdlaspec妇(N“1-9m晦2-S) 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究2-3结论综上所述，本章所采用的每种方法均可将大籽猕猴桃区别于其它猕猴桃，但没有一种方法能单独分别鉴别常见的9种药用猕猴桃茎干饮片。综合药材性状观察法、荧光反应法、紫外光谱法、荧光光谱法的分析结果，可达到完全、准确的鉴别效果。鉴别检索表如下【括号内的一对数值分别为最大吸收波长k。(单位am)、吸收值A(紫外光谱)或吸收强度I(荧光光谱)】：1．髓部实。或近实心；醇提液的荧光光谱有2个峰z髓部淡褐色；磐外光谱：水提液强吸收峰(280，0．55)，醇提液强吸收峰(280，0．71)，氯仿提取液强吸收峰(284，051X氯仿提取液在365nm下无可见荧光，仅水．醇提取液有淡紫色荧光；荧光光谱：水提液峰(456．2，5．08；645．6，3．79)，醇提液(353．4,3．79；606．0，210)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．5异色裤猴桃2．髓部白色；水提液紫外光谱为肩峰；氯仿提取液365m下蓝紫色荧光；3．横切面上韧皮部红棕色，未质部浅红棕色；紫外光谱：水提液肩峰(266-279．0．23)，醇提液强吸收峰(279,0．63)，氯仿提取液吸收峰(282'0．45)，石油醚提取液吸收峰(282,1．12k仅重蒸水和氯仿提取．施在36511111下有荧光；荧光光谱：水提液峰(450L0’2．92；645．8，4．69》，醇提液(343．4’4．81；606．6，2．20)⋯⋯⋯⋯⋯⋯～l大籽葬猴桃3．横切面上韧皮部近白色，未质部黄白色：紫外光谱：水提液肩峰(265-275，0．37)，醇提液肩峰(269-275，0．44)，氯仿提取液吸收峰(282,0．58)，石油醚提取液吸收峰(282,1．36k4种提取液在254，365m下均有荧光；荧光光谱：水提液峰(451．6'3．71；645．6，2．58)，醇提液(353．4，4．09；606．2，1．91)一⋯⋯⋯⋯⋯⋯2时萼释猴桃1．髓部片层状，醇提液的荧光光谱有2-3个峰4-髓片白色至淡褐色5．4种提取液在254．36511Ltn下均无可见荧光：紫外光谱：水提液强吸收峰(279，0．56)，醇提液强吸收峰(279，0．58)，氯仿提取液吸收峰(282,0．61)，石油醚提取液吸收峰(270，1．43k荧光光谱：水提液^瓤445．2，1．53；645矗2．06)’醇提．液(349．o，4．29；606．2，1．98k树皮光滑，紫褐色，呈环片状剥落，横切面上导管孔径较大，排列成同心环状，粉碎物纤维化程度较高⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。3黑麓繇猴桃5．有2习种提取液有可见荧光；水提液紫外光谱弱吸收峰或肩峰6．仅水．醇提取液在365ii．m下有淡紫色荧光；紫外光谱：水提液强吸收峰(265-280，0_55)，醇提液强吸收峰(2死0．49)，氟仿提取液吸收峰(268-280,0．35)，石油醚提取液吸收峰(270,1．24k荧光光谱：水提液峰(449．0，1．62；645．4’1．57)’醇提演(349．8'4．18；606．8，2．04X村皮光滑，紫褐色。呈条片状利落，粉碎物纤维化程度较低⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．4紫果裤襄桃4l 博士学位论文：抗肿窟中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究6．水．醇提取液在254、36511111以及氯仿提取液在365illn下均有淡紫色．蓝紫色荧光；紫外光谱：拳提液强吸收峰<279，0．43)，醇提液强吸收峰(277，0．“)，氯仿提取液吸收峰(280,0．32)，石油醚提取液吸收峰(270，1．13k荧光光谱：水提液峰(454．4，12；645．6,1．84)．醇提液3个峰(345．0,5．65；388．0，6．05；606．4,2．08k树皮粗糙，灰褐色，有纵裂纹，一般不剥落，粉碎物以粉末为主⋯7毛花猕获楗4．髓片深褐色7．4种提取液在254．365Ⅲ下均无可见荧光；紧外光谱：水提液强吸收峰(280，0．71)。醇提液强吸收峰(280,0．70)，氯仿提取液吸收峰(283．0．30)，石油醚提取液吸收峰(270，1．13k荧光光谱：水提渔峰(454．6,1．91；645矗2．21)，醇提液2个峰(350．4，3．70；606．4,2．12k树皮紫褐色，横切面上导管孔径较小，数量较少，排列呈同G环状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．⋯⋯⋯⋯⋯～⋯⋯⋯⋯．8小叶猕猴桃7f有3种提取液有可见荧光：醇提液荧光光ia-：有3个峰：树皮灰棕色，横切面上导管孔径较大，数量较多，排列分散&水提液淡蓝绿色～蓝绿色荧光，醇提液在365nm下蓝色荧光；紫外光谱：水提波强吸收峰(281，0．39)，醇提液强吸收峰(280,0．66)，氟仿提取液吸收峰(284，0．铝)，石油醚提取液吸收峰(270,1．24k荧光光谱：水提液峰(469．6'16．82；645．6，1．43)，醇提液3个峰(351．4，2．66；422．4’s．00；606．2，2．00k横切面上韧皮部黄褐色，木质部红棕色至棕黄色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．9中华猕猴桃8．水提液淡紫色荧光，醇提液在365nm下紫色荧光；紫外光谱：水提液强吸收峰(281。0．76)，醇提液强吸收峰(280。m68)，氯仿提取液吸收峰(279。0．45)，石油醚提取液吸收峰(270,1．37k荧光光谱：水提液峰(465．4．3．30；645．6,1．60)，醇提液3个峰(359．4，2．98；413．2'3．15；606．2，1．99k横切面上韧皮部深褐色，木质部黄色⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯。‘长叶猕猴桃 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究第三章大籽猕猴桃及其近缘种生药粉末的FT-IR鉴别传统的理化鉴别方法往往需要用溶剂提取药材的租提液或分离有效部位，操作较复杂、费时．近年来发展的以生药材粉末为分析对象的红外光谱法(包括傅立叶变换红外光谱FT-IR、傅立叶变换拉曼光谱FT-Raman、傅立时变换近红外光谱FT-N1R、漫反射傅立叶变换近红外光谱DR—FTIR、衰减全反射傅立叶变换红外光谱ATR．F11R)应用于中药鉴别与质量监控，取得了良好效果和长足迸展(孙素琴等，2000，2003a)．它有如下特点与优点：第一指纹性，纯化合物的红外光谱反映了分子内部各种基团具有的特征性振动。对于一个混合物体系而言，其红外光谱中峰位、峰形、蜂强代表体系中所含相应各种基团的谱峰的叠加，混合物组成的变化，将导致红外光谱整体谱图的变化，因此便构成谱图的宏观指纹性。利用这种宏观指纹性，可以直接地或者稍作数学处理进行中药的鉴定与质量控制。这也正是宏观指纹法的基础。第二，对被测样品的状态无苛求，气态、液态与固态均可以．因此在大多数情况下，对试样的测量可以做到不失原本性，无损性。第三，简便、快捷，对试样只作物理粉碎压片等简单的处理，无需经过繁琐的浸取分离过程即可直接测试。而且仪器较为通用，测量操作简便，易于推广应用。第四，对中药进行的全组分测定获取全貌整体信息，因此不破坏配伍性。第六，可以利用公认的，药效稳定的药材、成药直接进行标准化，不必专门寻求单个的、纯的标准物(孙素琴等，2003b)。本文采用傅立叶变换红外光谱法(Fr．1R)直接测定9种猕猴桃茎于生药材粉末的红外光谱，并进一步采用谱图相减法提高分辨率，以期达到快速、便捷的鉴别效果．3．1材料与方法供试种类见表2-1，2003-2004年秋冬季采集的直径约2cm的成熟茎干粉碎后过200目筛，密封干燥备用。取约3mg茎干粉末加约250mgKBr研磨均匀，液压器500kgf／cm2压片30s，Nexus470FT-IR光谱仪(美国Nicolet公司)测定红外光谱，分辨率4cnl-‘，测量范围4000-400cm～，16次扫描累加。所得谱图经OMNIC6．1软件基线校正，将其它7种猕猴桃的光谱图分别与中华猕猴桃红外光谱图相减，得相减光谱图，计算不同光谱图问的相似度，比较其它猕猴桃与大籽猕猴桃的差异程度。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究3．2结果与分析3．2．1精密度试验取同一样品供试片连续测定5次，所得红外谱图完全一致，相似度分别为100％、100％、100％、100％、99．97％，RSD=2．5×lo-"．3-2．2稳定性试验取同一样品片放入真空干燥器内保存，每隔lh测定1次，结果5h内所得谱图基本一致。谱图问相似度分别为100％、99所％、99．96％、99．96％、99．95％，RSD=2．5X10-8。3．2．3重复性试验取1份样品，称量、压片5次，所得红外谱图比较一致．谱图问相似度分别为100％、99．73％、99．07％、99．78％、98．96％，RSD=2．1X10．7．3．2．4大籽猕猴桃与其它猕猴桃的红外谱图差异图3-1为9种猕猴桃茎干生药材的红外光谱图，由图可见9种猕猴桃的蜂位、峰形大体一致，显示了较近的亲缘关系，但仍可观察到峰强的显著差异和峰形、峰位的微小差异，尤其中华猕猴桃和毛花猕猴桃出现强烈的末端吸收，明显不同于其它7种猕猴桃。进一步将大籽猕猴桃等7种猕猴桃的红外光谱与原始图谱差异较大的中华猕猴桃相减得到的相减红外光谱则显示了明显差异(图3．2)。鉴别检索表如下：1．有强烈未端吸收互760cm"1处无明显吸收峰，整体峰强较低，相减图中最大负峰峰住为1650-1622∞一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一9中华肄猴橇2760ClII"1处有一小峰，整体峰强较高，比中华赫猴桃高50％左右，相战图中最大灸峰峰住为1620C]fl[1"1⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．7毛花猕猴桃1．末端吸收不显著3．相减图谱中2921cnl"’处有一正峰4．相减图谱中1319cl'n"1处有一正峰5．相减图谱中1417cm"1处有一正峰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯，2对萼猕猴桃5．相减图谱中1417cm"1处有一负峰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．3黑磊猕嵌桃4．相减图谱中1319cnl"‘处有一负峰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6长叶释疾桃3．相减图谱中2921cm"1处有一负峰6．3500-3300cm"’处有2个正峰，1793Clli"‘处有一正峰，514cm"1处有一正 博士学位论文：抗肿窟中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究峰⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．1大耔猕猴桃6．3500-3300cm"1处只有1个正峰，1793cm"1．514cm"1处无明星峰7．1319cm"1处有一正峰，3600-3100cm‘1最大峰强的峰位为3362cm"1⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．4紫果猕囊桃7．1319cm"1处无明显峰，3600-3100cm*1最大峰强的峰位为3419Crll"18．1700-400ClII"1问峰强明曼较高，1000cm"1左右的负峰峰位为1000cm"1⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．8小叶弱嚷桃&1700．-400Cnl+1问峰强明显较低，1000Cliff"1左右的负峰峰位为964cm"。⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5异色猕猴楗进一步的相似度计算结果表明(表3．1)，大籽猕猴桃红外光谱与黑蕊猕猴桃最相似(73．48％)，其次是对萼猕猴桃(59．87％)、紫果猕猴桃(59．38％)，再次异色猕猴桃(51．04％)、长叶猕猴桃(46．57％)、小叶猕猴桃(45．59％)，中华猕猴桃、毛花猕猴桃与大耔猕猴桃的差异最大，相似度仅23．50％、27．64％。表3．19种猕猴槐红外光谱相嚣L度(％)Table3·iSimiLarity村FI'-IRspectrafromiae．4ct／n／d／．as衅dB‘％) 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种舶活性比较研究*HN*'_，，-_-__●删，⋯一谕一。～’妊⋯⋯一；一圈3．1'种猕猴槐茎干生药粉末的红外光谱(1：大耔猕猴执，2：对孳猕装撬。3：黑蕊猕猴槐，4；紫果猕猴橇：5：异色猕猴楗。‘．长叶嚣猴桩．7：毛花猕蔟桃，s：小叶猕猴撬．九中华裤猴槐)Fig．3-1lrl'．1RspcctnofnDwmaterialpowderfromnineAc矗n／d／ospecles(1：^macrosperma,2：^ndvm,3：^metanondre,4．，Lm-gu／avat．purpurea,s：^∞配D柏VjIiFod／sco／or,‘：^‰Hd咎叭l7：且edantha，矗．正7-nceoldm,兜一Lchinensls)一1一■j廿^o 博士学位论文：抗肿瘟中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究●磐：·栩{2_MI¨f--●__●_-■_¨{图3-2大耔猕猴枕等S种挤簇枕与中华猕猴桃的红外光谱相减匿(1墙见圉34)F孽3-2SubtractionspectradtbeotherelgbtAlcl／n／dia邓echwithal．c&hte础(N“1．sseeFtg．3-1) 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究3．3讨论红外光谱鉴别生物材料的应用由来已久，尤其是随着光谱技术和化学计量学的发展，红外光谱的鉴别应用取得了良好效果和广泛应用。Naumannetal于1991年最早报道了其在微生物鉴别中的应用，此后红外光谱法结合化学计量学方法如层级聚类分析法(HCA)、主成分分析法(PCA)、人工神经网络法(ANN)等，应用于微生物的分类、区别、鉴定，主要是系统分类鉴别，还有革兰氏阳性／阴性、对抗体敏感性、不同培养基培养的细菌的鉴别，取得了重大进展(Mafieyetal，2001：Zhaoetal,2006)。在医学领域的应用效果也令人瞩目，如人类，动物病原细菌和真菌的鉴别(Erukhimovitchetal，2005)√L类肿瘤组织的鉴定(RichteretaI，2002)、人结肠细胞繁殖的考察(SalmanA，2004)、离体肺癌细胞对化疗药物反应的评价(Sule．Susoetal，2005)等。中药材是一混合物质体系，同种药材的基源往往较混乱，而药材性状鉴定对经验依赖性较高，准确性不强，孙素琴等(2003a)对中药的红外指纹图进行了系列研究，证明无损、快捷的红外光谱在中药鉴别中具有突出优点。黄昊等(2003)采用Fr-IR法对五加科、桔梗科、木兰科、樟科、豆科、蕨类等科目中的常见药用植物进行了系统研究，比较了各科内植物的异同，结果表明不同科属的药材之间红外谱图差异较大。本文9种猕猴桃茎干生药材粉末相似的红外谱图表明了9种材料较近的亲缘关系，也进一步证实了整体性和模糊性的红外光谱其指纹性是具有一定遗传基础的。本文结果显示，与大耔猕猴桃红外光谱最相似的3个种黑蕊猕猴桃(73．48％)、对萼猕猴桃(59．87％)、紫果猕猴桃(59．38％)亲缘关系上也是最接近的，同属净果组，而斑果组的异色猕猴桃(51．04％)，糙毛组的长叶猕猴桃(46．57％)，星毛组的小叶猕猴桃(45．59％)、毛花猕猴桃(27．64％)、中华猕猴桃(23．50％)与大耔猕猴桃的红外图谱相似度递减，这与该属目前公认的进化路线和亲缘关系远近是基本一致的。说明红外光谱在生物系统分类上的应用有望从微生物拓展到植物。本文通过比较9种猕猴桃红外谱图的差异，发现红外光谱原始图对近源物种的鉴别效果较差，如文中除中华猕猴桃和毛花猕猴桃出现强烈末端吸收而明显区别于其它7种猕猴桃外，总体上9种猕猴桃的红外谱图的峰位、峰形十分相似，仅峰强存在一定差异。但进一步比较大耔猕猴挑等7种猕猴桃与中华猕猴桃红外谱图的相减谱图，分辨率大大提高，可完全、准确地区分了9种猕猴桃。表明 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究FF-IR法应用于近源药材的鉴别时，对原始谱图作迸一步处理或者结合化学计量学方法将大大提高该方法的鉴别能力。红外谱图的相似性比较表明，猫人参的常见混用品黑麓猕猴桃的物质组成与大籽猕猴桃最接近，长期以来一直用作猫人参的对萼猕猴桃与大籽猕猴挑的相似度其次，而猫人参的其它混用品小叶猕猴桃、中华猕猴桃与大籽猕猴桃的相似度较低，尤其是中华猕猴桃与大籽猕猴桃的相似度最低，仅23．50％，差异较大。因此，从红外图谱揭示的化学成分相似性的角度，与大籽猕猴桃相似度较高的黑蕊猕猴桃、对萼猕猴桃、紫果猕猴桃、异色猕猴桃有可能可以扩大为猫人参的药源，而相似度较低的小叶猕猴桃、中华猕猴桃则不宜混用为猫人参，当然准确的结论还有待对其化学成分和生物活性等的全面研究。 博士学位论文：抗肿痛中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究第四章大籽猕猴桃及其形态相似种的PCR．RFLP鉴别大籽猕猴桃形态上与对萼猕猴桃及葛枣猕猴桃较相似，尤其营养生长期较难区别，以致作为猫人参引种或入药时，容易混淆种源。DNA分子标记具有较高的准确性和稳定性，近年来应用于药材道地性鉴定及近缘生药和易混淆生药的鉴定，取得了较大进展，并显示了良好前景(曹晖和刘玉萍，1998；李晓波等，2002)。RFLP分析利用特定DNA片段碱基替换或插入，缺失丽导致限制性酶切位点的变异，用一组限制性内切酶对基因组或某基因片段进行消化，荐电泳分离、染色后观察限制性片段式样的多样性。早期的RFLP分折是对整个cpDNA基因组进行消化，并需傲Southern杂交，PCR技术发明后，大大降低了模板DNA的量，并可选用不同引物扩增不同片段，从而促进了PCR—RFLP技术应用的迅速发展。PCR—RFLP技术基本是在本世纪初才开始应用于药用植物鉴定，但其鉴别效果良好，近年来得到了较好的应用。日前中药分子鉴定中，PCR-RFLP分析片段多采用rDNA转录内间隔区(HS)，如人参属(Panax)6种植物及其2种易混伪品(Nganetal，1999)；4种药用党参：党参(Codonopsispilosula)、川党参(Ctangshen)、素花党参(Cmodesta)、大花党参(CnerPo∞vat．macrantha)及其2种掺杂品：士党参(Campanumoea扣vanica)、桔梗(Platycodongrandiflorus)(Fudal，1999)；束花石斛(Dendrobiumchrysamhum)、流苏石斛(D’fimbriatum)及其形态相似种；伊贝母(Fritillariapallidiflora)及同属的8种贝母(Wangetal，2005)。另外，限制性内切酶Ndel、Taql对5S．tRNA非转录间隔区(NTS)的酶切图谱有效区分了Salviadivinorum及其混淆品鼠尾草(&o庐cinalis)(Berteael'a／，2006)．cpDNA的PCR．RFLP报道较少，仅见Gongctal(2006)报道桃儿七(Sinopodophyllumhexandrum)cpDNAtrnD-trnT片段的^胁啦、Ddel酶切图谱可区别于八角莲属植物(Dysosmdspp．)。本研究旨在通过cpDNA的PCR-RFIJ标记，寻找大耔猕猴桃特异性酶切式样作为其准确鉴定的依据，以保证抗癌中药猫人参种源的纯正。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究4．1材料与方法4．1．1试验材料4⋯111试剂与仪器试剂：十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)上海生工生物工程有限公司进口分装B一巯基乙醇SigmaChemicalCo．三羟甲基氨基甲烷(Tfis)上海生工生物工程有限公司乙二胺四乙酸(EDTA)(分析纯)上海生工生物工程有限公司琼脂糖上海申能搏彩生物科技有限公司溴化乙锭(EB)上海生工生物工程有限公司RNA酶上海申能博彩生物科技有限公司Taq酶上海申能博彩生物科技有限公司dNTP。上海申能博彩生物科技有限公司DI，2000Marker宝生物工程(大连)有限公司PCR扩增引物上海生工生物工程有限公司丙烯酰胺(Arc)上海生工生物工程有限公司进口分装甲叉丙烯酰胺(Bis)上海生工生物工程有限公司进口分装尿素(BBI级)上海生工生物工程有限公司进口分装过硫酸铵(AP)上海申能博彩生物科技有限公司N，N，N，N．四甲基乙二胺呷MED)上海申能博彩生物科技有限公司甲酰胺上海申能博彩生物科技有限公司溴酚蓝上海申能博彩生物科技有限公司二甲苯青上海申能博彩生物科技有限公司进口分装限制性内切酶PromegaCo．其它常用试剂(均为分析纯)：氯化钠、氢氧化钠、无水碳酸钠、硝酸银、硫代硫酸钠、盐酸、无水乙醇，氯仿、异戊醇、异丙醇、冰醋酸、甲醛 博士学位论文：抗胂宿中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究主要仪器：BIO101FastPrepFPl20粉碎机台式高速离心机DYY-2C型电泳仪DYCP．34A型水平电泳槽IS．380A自动凝胶成像分析仪m100PCR仪DYY-10C型电泳仪DYCZ-24A型垂直电泳槽zDj9556水平摇床4⋯112溶液配制2×C瑚NaClTris(1M，pH8．o)EDTA(0．5M，pH8．o)CI：他8．巯基乙醇’11lermoSavant,US上海医用分析仪器厂：Eppendorf北京六一仪器厂上海培清科技有限公司BIORAD,US北京六一仪器厂太仓科教器材厂40．9950ml25ml2092％(临用时加)加重蒸水至10X(11AB，NaCICI：惦Naa1000ml1094．1g加重蒸水至50×TBE1lis硼酸EDTA(0．5M，pH8．o)100ml108955940mI加重蒸水至1000mI 博士学位论文：抗肿窟中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种豹活性比较研究5×TBETris碱硼酸EDTA(o．5M，pH8．o)54927．5920ml加重蒸水至高盐TETris‘cI(pH8．mEDTA(pH8．o)NaClTETris‘CI(pn8．mEDTA(pH8．o)40％Act-BisActBis1000ml10mM0．1mMlM10mMlmM38929加重蒸水至100ml(过滤，抽真空，避光4"C保存)上样缓冲液甲醛溴酚蓝二甲苯青EDTA(0．5M，pH8．o)9．8ml0．02590．2ml 博士学位论文：抗舯窟中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的话性比较研究4⋯113植物材料供试材料均取自野外或移栽到浙江大学植物园的野生植株的新鲜嫩叶(表4-1)，并用硅胶干燥后备用．表4-1供试材料Table4-1幽ofsts击．edmaterials，大耔猕猴桃正macrosperma浙江杭州大耔猕猴挑^macrosperma浙江富阳三山大耔猕猴槐^macrosperma浙江富阳三山大耔猕猴槐^nmcrosperma浙江富阳环山实髓系大耔嚣猴挑正moesperma江西武陵SeL50lidae对萼猕猴挑^whm口江西武宁净果组对萼猕猴撬^valvata浙江临安限溪ScnLeiocarpae对萼猕猴桃丘valvata新江天目山对萼猕猴桃^valvata湖北武汉葛枣猕猴槐JLpolygama四Ⅲ成都．紫果猕猴桃正4学出vat．purpurea新江百山担片髓系黑蕊猕猴挑^帕妇M戚r4江西武宁13海棠猕猴枕^nudobdes四川蛾眉山A2004047’武汉植物园引种栽培4．1．2试验方法4．1．2．1总DNA提取在Doyle(1987)和AIjanabietal(1997)的基础上，并采纳Lodhietal(1994)的建议使用高浓度CTAB及NaCI除多糖。具体步骤如下：1)选取1．2锄2(20-30rag)叶片，置BIO101管中加磁珠研磨成粉末，加入65℃预热的2XCTAB800Ⅳl，震荡混匀后，65℃水浴30min，水浴过程中每隔5min颠倒摇匀一次；2)冷却至室温，加等体积的氯仿：异戊醇(24：1)，颠倒混匀，平衡后。10000惭{lll；|帆姗嘶愀姗蔓|帆眺吣毗眦觚∞观m帅m帅一m帅爰三爰差。23．P678铲”n圪 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究rpm离心10rain；3)吸取上层水相转入新的1．5ml离心管，加入1／10体积的10×CTAB／NaCI，轻轻混匀，再加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)抽提，重复步骤3；4)吸取上层水相转入新的1．5mI离心管．加入2／3体积．20℃预冷的异丙醇，轻轻摇动，4"C放置O．5一lh，8000rpm离心1-5min，使DNA附着离心管管底，弃水相；5)加75％乙醇洗涤2次，用无水乙醇洗涤1次，风干；6)用100JllTE溶解DNA；7)取4口lDNA于l％琼脂糖凝胶中120V电泳检测，其余DNA置．20"C保存．4．1．2．2PCR扩增(1)PCR反应体系：25／zl体系(乒1)50脚体系(／z1)ddH2015．7531．510×bufier2．55M92+2．04dNTP0．51．0Primerl1．o2．OPrimer21．02．0DNA模板2．04．0Taq酶0．25O．5常规PCR扩增程序：94℃，4rain一(94℃，1min一52"12，1min一72"(2，1．5min)X35次循环一72℃．7rain一10℃保存．选择大籽猕猴桃、对萼猕猴桃，葛枣猕猴桃各一个样品进行PCR反应条件的优化。(2)引物筛选：供筛选的引物见表4．2，选取表4．1中2．大籽猕猴桃(富阳三山)、8-对萼猕猴桃(天目山)、10-葛枣猕猴桃(四川成都)三种材料进行常规PCR扩增。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究表4．2供筛选的扩增c'pDNA的通用引物Table4-2Univet',r．alpdme曙usedforcPDNAseq眦n∞liltpli晒t‘¨(3)模板浓度筛选选取表tl中4．大籽猕猴桃(富阳环山)、8-对萼猕猴桃(天日山)、10一葛枣猕猴桃(四川成都)三种材料DNA分别稀释lO、50、100倍，用筛选的引物常规PCR程序筛选最佳模扳浓度。(4)退火温度的筛选：确定52-68℃为拟筛选的退火温度范围，由PCR仪自动生成温度梯度：51．2℃、53．5℃、56．4℃、59．8℃、62．6"0、64．8"0、66．4"0、67．8"0、68．O℃．选取表4—1中4．大籽猕猴桃(富阳环山)、8-对萼猕猴桃(天目山)DNA为模板，用筛选的引物扩增。根据筛选的最佳条件，扩增所有样品。PCR产物质量均用1．5％琼脂糖凝胶120V电泳检测。4．1．2．3酶切及检测(1)酶切体系： 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究10脚体系(一)ddHzO3．65Buffer1．0BSA0．1内切酶o．25DNA模板5．0酶切条件：37℃水浴过夜。(2)尿素．聚丙烯酰胺凝胶电泳：①制胶：搭建电泳槽，lj％琼脂糖封底，每块垂直板加入约30m16％凝胶溶液。尿素(7M)ddH205×TBE40％(Axc：Bis)lO％APTEMED30nd4．5915．9mI6ml4．5ml300／Y115“I60nd9932mi12ml9mI600川30#1②电泳：凝胶凝固后，55mA预电泳30min．10／A酶切体系加5ⅣI上样缓冲液点样。55mA电泳10rain左右，使溴酚蓝和二甲苯青两条带分离，再调整电流为25mA继续电泳，直至溴酚蓝前沿将至底部时结柬。③固定与脱色：将胶在水中取下，双蒸水洗1．2次；10％冰醋酸(v／v)摇床脱色60rain，直到溴酚蓝和二甲苯青颜色消失，双蒸水洗胶3次．④染色：0．1％AgN03溶液(1gagN03+1．5ml甲醛，重整水定容至1000mi)摇床染色25min，用双蒸水洗胶2次。⑤显色：将胶放入显色液(309无水Na2C03+6mg硫代硫酸钠+1．5ml甲醛)显色，水平摇动。@终止：条带显色达到满意程度时，加10％醋酸溶液终止染色。用水洗净胶，拍照。(3)限制性内切酶的筛选：①从GeneBank中下载大籽猕猴桃、对萼猕猴桃、葛枣猕猴桃、黑蕊猕猴桃、 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究异色猕猴桃，长叶猕猴桃、毛花猕猴桃、中华猕猴挑等的marK基因序列，用Sequencher4．0．5软件分析其限制性内切酶酶切图谱，根据酶切图谱的差异确定合适的限制性内切酶。用Clustalxl．81、BioFxlit7．Ol进行序列比对，寻找变异位点．②供筛选的限制性内切酶见表4．3，选择大籽猕猴桃、对萼猕猴桃的PCR产物用于筛选。根据筛选结果，酶切全部样品，筛选大耔猕猴桃的特异性酶切片段。表4-3供筛选的限斜性内切酶T'age4_3Re_trictJouEndodeaseusedforscz*rdng坠堕塑鲤丝1DdeIC删AG2DrnI硼}氏}A3EcoRlGIAATTC4HaeIllGG／CC5Hul,dIⅡA／AGC'IT6肋旷IG／AHTC7MspIGCGG8RsaIGT／AC4．2结果与分析4．2．1PCR反应条件优化总DNA电泳图(图禾1)显示，各样品模板DNA质量较佳，用于下一步PCR反应。引物筛选结果见图乖2，由图可见，引物KK、SM、ML的扩增效果较好，选择三者供下一步试验。模板浓度筛选扩增结果见图4．3，由图可见，大耔猕猴桃DNA模板稀释100倍扩增trnK、trnS-trnfM、trnM-rbcL片段最佳；对萼猕猴桃稀释50、10、100倍分别扩增trnK、trnS4rnfM、trnM-rbcL片段最佳；葛枣猕猴桃稀释10、lO，50倍分别扩增trnK、trnS-trnfM、trnM-rbcL片段最佳。根据该结果，设定表4．1种各样品DNA稀释倍数分别为：1-×100、2-×10、4-×100、5．×50、@X50，■x100、8一×100、10．×50、11．×50，4、9、12—17不稀释．退火温度筛选结果见图44、图4_5．由图可知，trnS-trnfM的扩增效果并不理想，因此弃用，trnK、trnM-rbcL的最佳退火温度分别为65℃、60℃．根据优化的条件，全部17个样品的扩增结果见图4．6、图4．7。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究圈4．I总DNA质量检测(1一17详晃表4-I，M：DL-2000marker)晦4-1Detection时DNAqualification(N“!-17seeTable4-1，M：DL-2000marker)圈4120对引物的扩增效果(I：大耔猕猴撬，2：对萼猕猴挑．3．葛枣猕猴桃，O=空白对照，M：marker)Fig．4-2Amplificationorstnirsofprimers‘l：正macrospenma，2：^mf№，3：A．potygama，O：blankforcontrol,M：marken圈4．3不局浓度模扳对扩增的影响(1．大耔猕猴挑，厶对萼嚣弦槐，3．葛枣猕猴桂：⋯12、-3表示稀释lO．50，100倍：M：marker)Wwo．4．3Effectofternlptateconc∞trationon-mpIiflcation(1‘^macrospenna，2-：^valvata，3·：^polygama；·l：dilutionxi乱-2：dilutiouxS0,-3：dilutioaxl00；M：matt日) 堡主兰堡笙苎!堕竺堕±兰堑箜△竺竺堡堕鳖型墨墨皇堑望壁竺堡丝些墼堕壅囝4-4不同退火置度对tmK、加ls拥M片段扩增的影响(1-9分捌为51．2、翳5、56．4、59．8、626，“鼻，Fig．4-4EITcclofamumltemperatureon锄叩雠b畦伸dtmKaddtmS-OwMsequences(14：51．2’5I与56．4,598,67．5,砌，6媳67丑68．0"C；M：m删圄4．5不同退火墨度对tmM-r／,cL片段扩增的影响(14分别为51．2、弱5．靳』，59．8．62．6，‘4工’66．4、67．8、68．0"C；M：market；mx：大耔猕猴槐；vat：对萼猕猴执)E}4-5Effectdsss嘲dtemperature佃smtificatioaof拥M靠cLo川-蛐∞(I—'：SI五驺五56．d,5'墨62．6,“矗66．4,67．8,68．0"C；M：mrk嵋,I∞lc^m∞嘲wm町val：丘va／v,d-)固4．‘弓l物KK对17个样品的扩增效果(1一17详兕兜页表4．1。M：marker)F'tg．4-6Amplific埘osoftreksequescesfroml7samples(No．i-17seeTsbie4-1缸陴S2’M：_”|【erJ60 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究圈4．7引物ML对"个样品的扩增效果(1一17详见52页表4-l，M；am'ter)Fig．4-TAmpnllcafieaor拥M寸kL$eque口。幅(No．1-17瓣TM，IIe4-1iap，薛S2,M：marker)髓4-s‘种限制性内切酶对KK、ML片段的酶切式样(I、2、乳大耔猕猴撬，‘、'’s；对萼猕猴槐M：marker)F'嘻．4-SRestrictioaI妊ttemofKKseqaeacesby‘RE摹(1，2'3：^nuu'm例；‘，7'0：^阳如咖；M：日I-rkn4．2．2酶切反应4．2．2．1限制性内切酶的筛选用Sequencher软件对供试的10种猕猴桃cpDNA的matK序列进行酶切位点分析，结果表明Ddel、Dral酶切大耔猕猴桃mark基因(包含于trnK片段中)后产生特异性酶切式样．此外，Sequencher软件中没有收录的限制佳内切酶(EcoRl、Haelll、Hindlll、Hinfl、Mspl、Rsal)对大籽猕猴桃、对萼猕猴桃的酶切图谱见图4．8。筛选结果表明，Hinfl、Rsal对trnK片段，HaelIl、Mspl、Rsal对大籽猕猴桃的trnM-rbcL片段可能有特异性酶切条带。选择Ddel、Dral、Hinfl、Haelll、Mspl、Rsal等内切酶迸一步酶切全部样品的相应片段。6I 卜卜卜卜卜卜卜II,U卜■卜卜磐。卜卜卜卜卜《《《《《U《《《《uUU《UU卜卜卜4尊口}_卜卜卜卜o5和ooU口氇UUoo扣ooU卜卜卜卜}_卜}．o卜卜UU■UU扣口‘，}_卜卜卜卜卜卜UU《Uoq《oo疆oo鲁一oo一卜卜卜卜醢卜卜卜卜卜卜扣卜卜卜甜卜一龆目UUoto《譬U《《《《《《《-UU卜卜卜卜卜p卜。卜卜uUu矗和静静和卜卜卜一卜一}_卜卜和U‘JU■pU《《《《《《《《n《口《《《《《《《《《《UU嚣繇舔H菸墨馨蒋鲁壬嚣《舔肆呼嚣馨蠡古攀嚣冀蒋田咪毒藻蒋鹳睦嚣誉蠡静嚣嚣蝶萜静肆筇冀熊冲寅茸馨藉聋K甘g是峥崎∞吣。一寸a婚n19n矗量『＼嚣弓。已∞嚣蒸嚣H糖毒繇舔噼F壬筇纂舔撑御嚣饕蒋旨举嚣冀蒋锄昧嚣餐稿鹩《嚣替蒋静赫嚣艨舔静■茸餐蒋甘餐嚣冀燕馨K虮nnNnnnNn寸卜N∞噜H峪帅一on—n叶一一n一栅∞一Icq一盘口『、嚣13m△∞譬一鬈鲁J墨{q飞嚣．暑占0毒；g∞)I鼍EJo墨=no曼譬丑∞，葛IqJl．《犁掣球最世聋)I≈￡嚣艨蒋簿。一，，群茧誊第芏掣蜒g毒嚣鞫眢兰铽秦静餐毒g瓠、r糅板誓乎霉垂嚣．议秘犁扑÷茎 UU‘JU趱UU瓣稿Uo盛p嚣静豁扣卜卜卜■《《《《《磁《《嚣糍耥鬻氍ooo口ooU辩U秘瓣o馘锻Uo《《《《《《《《《U卜卜U毪}_卜卜一扣一卜}_U蜡旌UU赫U‘J&醢镰《《《《《《《oo口罐。铽瓠{；；；；l；；；n婚oo《oo—《o口《oo鼋oo《oo乏oo《嚣藻舔H糖嚣搽箍哥壬嚣蒜蒋撑岬嚣《臻吉翠嚣馨舔印睬嚣髹舔锵畦嚣爨舔静餐嚣馨舔静■嚣馨蘸静茛o《u扣u《卜。嚣繇蒋H籍o《稀《u《b．Lo嚣馨舔丹哥o《u卜臻u《h—o嚣搽舔撑卵o《u卜u《卜扣。毒辣蒋量半o《u卜u《．L卜。嚣繇蘸邮睬鞲o《u卜u《瓣卜。嚣繇蒋璃睦抟o《u卜u《豁■o筇馨蘸静餐撅瓣ou卜u卜礁h卜。嚣饕燕静拇辟罐静u卜u一口卜。嚣艨蒋聱智斟。虢u卜u《卜毪h莓替蓬辩K误事嚣翌拳蜒g嚣精盟?兰赵蠢辕坦毒g精<挥鬣*岳擘量罨。议髫单磐÷彗 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鐾j；唾及其与近缘种的活性比较研究4．2．2．2matK序列比对lO种猕猴桃matK序列比对结果见表4_4．由表可见，供试的猕猴桃序列变异均为点突变。大耔猕猴桃存在多个特异性变异位点，如25bp处的G突变为A(G—·A)、369bp(A—C)、600bp(C—·T)、676bp(C—·T)、761bp(G—+T)、1407bp(A—G)、1408bp(G—T)、1453bp(G—A)。同时，对萼猕猴桃与葛枣猕猴桃的matK序列十分相似，二者仅在1239bp处有差异，对萼猕猴桃的T突变为C。4．2．2．3特异性酶切式样筛选限制性内切酶Ddel、Dral对全部样品trnK片段的酶切式样见图4．9、4-10。由图可见，Ddel对大耔猕猴桃trnK片段有2个长度分别为950bp、370bp左右的特异性酶切片段，而其它种类与之相近的片段则分别大于950bp、370bp，或者缺失(图4-9)。Dral对trnK片段有2个长度分别为200bp、170bp左右的特异性酶切片段，而在供试的其它种类酶切图中均不存在这两条带(图4-10)。图4．11、4-12分别是有的内切酶酶切式样能够区别大籽猕猴桃与对萼猕猴桃及葛枣猕猴桃，但其特征条带往往也存在于同属的其它物种中(如图4-11、4-12)，因此不能代表大籽猕猴桃的特异性，无种间鉴别意义。然而，由图4-13可见，杭州产的大籽猕猴桃(No．1)明显不同于富阳、江西等地的材料；江西武宁(No．6)和天日山(No．8)产的对萼猕猴桃亦各不同于顺溪和湖北武汉居群的材料，表明该两物种存在种内居群问变异，而Mspl对其trnM-rbcL片段的酶切式样可作为其特定居群的指纹图谱．从图4-13中还可看出，供试的净果组种类(No．1～13)共同具有一条470bp左右的条带，而非净果组种类(No．1和17)不具有，表明该条带可能是净果组的特征谱带． 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究圈4-9Ddel对猕猴桃KK片段的酶切式样(1-17见52页表4．I，M：marker)Fag．4-9酗蛐fid；_patefllofKIKseqmeKesb，／Met(No．I一"see'lhble4_lh髀弘52；M：mrker)图4．¨Dral对磷猴槐KK片段的酶切式样(I-17霓s2页表4．1，M：marker)Fig．4-10R瞄tr‘c‘I帕patternofKKscqII哪蚵Dral(No．I—17豫Table4-1轴Pa妒52；M：marker) 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究圈4-11F．sal对猕靛瞻trnK片段的酶切式样(1017见52页表4．1，M：msrl日)Fig-4-11RestrictiooptterisdtmKs鹎m口c8蚵脑I{No．i-17seeTable4-1inpage52：；M：marker) 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究图4-12Haelll对猕猴挑tmM-rbcL片段韵酶切式样(1一17兕52页表4．1。M：marker)Fig．4-12RestrictiompatternolrtmM．rbcLseqtmzesbyHaelll(No．1-17seeTalde4-1hpageS2；M：mrken 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴男吐及其与近缘种的活性比较研究圈4-13Mspi对猕壤撬WnM-fbcL片段的酶切式样(i-1"／见52页表4．I，M：marker)rig．4．”Restfk-'tioai幢ttemoftrnM-sbeLsequeK苎竹M．q口l(No．1-17s竹Table4-1hpage52；M：mart刚4．3讨论大籽猕猴桃与对萼猕猴桃、葛枣猕猴桃形态上十分相似，经典分类学(梁畴芬等，1984)、叶片黄酮类化合物(Webbyctal，1994)、基于等位酶的分支树(TestolinandFerguson,1997)、基于matK和ITS的系统发育树(Lietal，2002)均支持三者是亲缘关系非常接近的分类单元，Lietal(2002)认为对萼猕猴桃与大籽猕猴桃为姊妹种，而对萼猕猴桃可能是大耔猕猴桃和葛枣猕猴桃的杂交种．因此这三个亲缘关系十分接近的种从形态上尤其营养生长期较难鉴别。PCR—RFLP法既结合了PCR和RFLP的优点，避免了单纯用RFLP带来的操 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究作繁琐等缺点，又弥补了序列测定和位点特异性PCR鉴别的不足(Fushimietal，1997；Brunnerelal，2001)，通过对待鉴定样品的DNA提取、PCR扩增、PCR产物的酶切、聚丙烯凝胶电泳就能得到鉴定结果，此方法对形态相似易混淆种类的鉴定具有准确、快速、价廉和重现性好等优点。叶绿体DNA序列保守性较高，进化速率较慢，因此多用于种以上水平的系统进化和分类研究等，结果令人满意(邹喻萍，2001)．本章研究表明利用PCR．RFLP方法，用DdeI、Dra!消化叶绿体trnK序列获得的限制性酶切图谱在物种水平上可有效、准确鉴别大籽猕猴桃与对萼猕猴桃、葛枣猕猴桃以及同属的其它近缘种。该方法对大籽猕猴桃及其近缘种的鉴别是理化方法鉴别的有效补充。大耔猕猴桃分子指纹图谱的建立对于猫人参GAP基地建设、中药材种植规范(SOP)、优良种质资源选择、药材道地性研究等都极为有用。值得注意的是。在中药分子鉴定中，供试样品的取样策略对鉴定结果的准确性有很大影响。在本章限制性内切酶的筛选试验时，Rsal对trnK片段(图4-11)与Haelll对trnM-rbcL片段(图4-12)的酶切式样中，虽然大耔猕猴桃具有对萼猕猴桃和葛枣猕猴桃所没有的条带，但这些条带同时存在于同属的其它近缘种中，因此这些条带并非大籽猕猴桃所特有，如果以其作为大耔猕猴桃的分子指纹图谱必然会导致以后的应用中出现错误鉴定。另外，从群体遗传学角度而言，种内居群问、甚至居群内的遗传变异是一种普遍现象，在未经评价的前提下，而仅以一个物种某个居群的分子图谱作为该物种鉴定的指纹图谱是不够科学、准确的．本章研究结果证实了这一说法，Mspl对trnM-rbcL片段的酶切式样(图4-13)显示，不同产地的大籽猕猴桃或对萼猕猴桃分子图谱并不完全一致，二者均存在一定程度的居群问变异现象。所以在中药材分子指纹图谱研究中，如果仅选择一两个居群进行分析，很可能会导致指纹图谱的准确性降低，从而影响鉴定结果。因此，足够数量的待测药材及其混淆品的居群样本、足够代表性的待测药材的近缘种样本对于建立准确的中药分子指纹图谱无疑是十分必要的。本文选取大籽猕猴桃5个居群的个体、对萼猕猴桃4个居群的个体、葛枣猕猴桃1个个体及经典分类系统中大籽猕猴桃所属的净果组的大部分种类，以及同属另三个组斑果组、糙毛组和星毛组的代表种类，因此筛选的Ddel、Drai大籽猕猴挑叶绿体DNAtrnK序列的特异性限制性酶切式样具有较高的准确性和可信 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究度，可作为大籽猕猴桃鉴定的指纹图谱．猫人参目前仍属小品种药材，对其道地性的研究尚未起步，但是可以预见的是随着猫人参道地性研究的逐步开展直至道地产区的确定，PCR-RFLP无疑可以有效应用于猫人参道地产区的分子指纹图谱鉴定。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴j；畸及其与近缘种的活性比较研究第五章9种猕猴桃体外抗肿瘤活性的比较研究猫人参有“红货”大耔猕猴桃和“白货”对萼猕猴桃之分，而且市场上还有黑蕊猕猴桃、小叶猕猴桃、中华猕猴桃等混淆品。富阳草药医认为，“红货”大籽猕猴桃种源最正宗，疗效最佳，“白货”对萼猕猴桃疗效其次，需加倍使用，而其它种类则都是假品。因此用科学方法来验证对萼猕猴桃及其它猕猴桃种类能否代用大籽猕猴桃已成为当务之急，对于保证猫人参的临床效果、规范其生药生产、扩大其生药来源，无疑具有较高的理论意义和经济价值．“中药谱效(关系)学”是中医药业内人士近年提出的正在倡导的、全新的、处于学术前沿的中药现代化研究思路(李戎等，2002)．它建立在中药指纹图谱研究的基础上，并与中药功效结果相结合的科学研究方向。目前中药的指纹图谱研究和药效评价思路基本参照化学药品的模式，以某个或某几个指标成分为考察对象。但传统的中医理论和医疗实践对现行中药质量控制的模式提出了挑战，中药的药效不是来自单一活性化学成分，而是来自多种活性成分之问的协同作用，逐渐得到共识。测定任何一种活性成分(包括指标成分)都不足以说明中药的内在质量．因此基于传统中医思路的综合质量评价模式中药谱效(关系)学应运而生．只有从将标示物质群特征峰的中药指纹图谱与功效结果对应起来、将中药指纹图谱中化学成分的变化跟中药药效动态联系起来的谱效关系学角度，才能为中药的质量控制和药效评价标准提供规律性的科学依据，从而建立中药产品与其疗效基本一致的反映产品内在质量的质量标准。该思路已应用于鱼腥草注射液(卢红梅等，2005)、厚朴(冯慧萍等，2005)等研究。本研究在本实验室初步筛选的猫人参有效部位(乙酸乙酯部分)的结果基础上，借鉴中药谱效学的基本思想，采用高效液相色谱分析与卤虫毒性及体外肿瘤细胞抑制试验相结合的方法，对大籽猕猴桃，对萼猕猴桃及其它近缘种类有效部位的抗肿瘤活性进行比较分析，为实践中其它猕猴桃种类能否代用大耔猕猴桃提供科学理论基础。5．1材料与方法5．1．I材料与制备供试的猕猴桃种类见表2-1。粉碎后，各用约1800ml95％酒精60-7012加热 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究回流提取3次，每次1h。提取液过滤后，减压浓缩得酒精浸膏。加150--200ml蒸馏水，超声波悬浮15min。依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁酵萃取至近无色，减压回收试剂，得到各分离部位，计算得率。根据本实验室的初步活性筛选结果，取乙酸乙酯部位做HPLC和体外抗肿瘤活性分析．5．1．2试验方法5．1．2．1H：PLCAgilent1100Series高效液相色谱仪(包括四元泵、真空脱气机、自动进样机、柱温箱、紫外检测器)。HyperSilC18拄(4．6mm×250mm，5／tm)：流动相：甲醇(色谱纯)7超纯水梯度洗脱，比例15：85～85：15；流速1．0ml／min；柱温：35℃：检测波长：254nm。进样量10／d。称取一定量的乙酸乙酯部位，用甲醇配成1mg／ml溶液供试验。5．1．2．2卤虫毒性试验在4Clll培养皿中倒入20‰人工海水，加入适量虫卵，28℃水浴培养24h后，幼虫用于毒性测试。待测样品溶于二甲基亚砜(DMSO)中，再用20‰人工海水分别稀释成1000、100、10ug／ml或1000、800、600、400、200／ag／ml的浓度梯度，DMSO的最终浓度为l％。以鬼臼毒素(本实验室制备)为阳性对照，I％DMSO人工海水为阴性对照。取96孔细胞培养培养板，每孔加样液200gl，每个样3个复孔，每孔加入10--15只正常卤虫，28℃水浴培养24h后统计存活个体数，并计算校正死亡率和半致死浓度(LCso)。校正死亡率=(对照组存活率．处理组存活率)，对照组存活率X100％20‰人工海水(pH8．5)氯化钠14．299硫酸镁3．09氯化钙O．369氯化钾0．189溴化钾0．029硼酸0．129加重蒸水至1000ml72 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究5．1．2．3体外肿瘤细胞抑制试验(MTT法)(1)试剂与仪器：小牛血清(杭州四季青生物公司)RPMI1640培养基(美国Gibco公司)阿霉素(Adriamycin)：浙江海正药业公司碘化丙啶(PI)：上海普飞生物技术有限公司链霉素：大连美罗大制药厂青霉素：石家庄制药有限公司MIT：Amresco分装．RPMI1640培养液：RPMI1640干粉IO．4凹，Hopes4．76矿，NaHC032．0鲫，青霉素lO万Un，链霉素lO万U，lMrr：美国Sigma公司胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶O．259溶于100mlD·Hanks液中．C02细胞培养箱：德国Hercaus公司KA-1000离心机：上海安停科技仪器厂酶联检测仪：Bio-Tck，USA倒置相差显微镜：OlympusIX70(2)供试的肿瘤细胞系人肝癌细胞株SMMC-7221、入肺癌细胞株A549、人胃癌细胞株SGC-7901。肿瘤细胞株来自中国科学院上海细胞研究所。(3)试验方法用RPMI1640培养液漂洗细胞一次，用EDTA消化细胞并计数，用体积分数为10％4,牛血清的RPMI1640培养液将细胞稀释至5x104／ml，取96孔板，每孔加稀释的细胞200／H1，温箱培养(37"C，5％C02)24h。弃培养基，取新培养基，按3倍稀释法将各待测样品配成243、81、27、9、3、1．0．33／Mg／mi系列溶液(含l％DMSO)，每个浓度3个复孔，每孔加200埘。阴性对照为1％DMSO，阳性对照为阿霉素(Addamycin)。37"C5％C02温箱培养48h。每孔加2q“I5mg／mI四甲基偶氮唑盐(MTT)，温箱继续培养4h，3000rpm、 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究II'C进行离心10min，轻轻倒出MTT溶液，每孔加2滴PBS溶液清洗多余的MTT，同上再离心一次，弃PBS洗液．每孔加200口IDMSO，振荡混匀，使沉淀充分溶解，10min后在96孔酶标仪上测定570nil]处各孔的吸收值CA)。依次求抑制率和半数抑制浓度(IC∞)．抑制率m％=(对照组A值一处理组A值)，(处理组A值．空白组A值)X100％ICso计算方法：以抑制率对样品浓度的对数值作图，从图上求出抑制半数细胞的样品浓度。上述试验在浙江大学医学院肿瘤研究所完成。5．1．2．4数据统计分析实验数据以g--+RSD表示，经方差齐性检验后，采用F检验，多样本比较用单因素方差分析，两两比较采用Newman．Keuls检验．5．2结果与分析5．2．1HPLC图谱9种猕猴桃乙酸乙酯部位的HPLC图谱见图5．1．由图可见，9个图谱总体上相似度较高，尤其保留时间10-12min的4个峰是9个种共有的，且峰面积差异不显著(表5．1)。在保留时间10．55min处均有一最强峰。表明同属的9个种因其亲缘关系较接近，次生代谢产物也十分相似。9个图谱的差异主要体现在保留时间1．3．5mill，9种猕猴桃在峰数和峰面积上存在一定差异(表5．1)．表5．1'种猕猴撬乙酸乙醋部位HPLC各峰的保留时问与峰面积TableI；-1Reteotlentimeandpeakat31目l“HPLCspdnofethylacetmefragmentsfremoiaeAe6n／d／as弘!d酋耵IIlIin)1．221．591．792．202．622．782．943．4210．2210．5511．47n．7‘12．“l5．243．4213·13．5·一．'．13695SS3，J5．22-一67．7·8．4．"3‘¨4北地．33326．926．5·39．1一13．8·lo．137免I5423'■8J545．6762843·一8．7·5．7如m44．23"“53．750．436五19．5鹋．626339．98．97』枷嘻．356J船工8．16—43卫54，8·141．7．2工“弼548m强I9．77一10．717．6·72．022323513．6&J4ln‘“24矗工．8··32．2·73．5·一·S』3，4．15lJ37』3929·31．565．715．796A49．2．-75艚3．7船』3'工9．8 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究蝴‘§，-抬Jh啉’■It：脚碍^扣⋯：ac●出m；黪It^●。：酗，h-*^j尊删≯●粕bM：q口■”4“啊^■ri"一，娩日}喜眦日+．伽．，·’oP'●o，e#a∞i珥3一一J^^——a日，●’■-纾‘-■一描≈口￡砖删#，。t《b●L删’§q●‘即∞．一^■峨州*绷^：t■口■垴圈5-1，种猕猴枕乙酸乙酯部位的HPLC图谱(1：大耔猕猴枕；2：对萼猕猴撬；3：黑蕊猕猴橇；4：紫果猕猴橇；s：异色猕猴撬；‘．长叶猕猴桃：7：毛花裤猴挑；s：小叶猕猴挑；'．中华猕猴桃)F培5-1HPLCspectraor劬yIMe‘，kfragmentsfromniaeActinidia$ped6tl：^macrospermm；2：^mb嘲嘭3．^加以m叭如；4：-4．舯譬珊口vat．purpurca；5：正棚肋船VIFo幽脚如一‘．正hemdeyana；7：正er／antha；8：^lanceolata；’．—|．chlnensis) 博士学位论文：抗肿窟中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究续嚷：一一5．2．2卤虫毒性试验9种猕猴桃乙酸乙酯部位对卤虫的致死作用见表5-2。Meyeretal(1982)认为，对卤虫的LD50<1000／zg／ml时，表明该药物具有一定的细胞毒性·从表5—2可以看出，除小叶猕猴桃和中华猕猴桃外，其余7种猕猴桃乙酸乙酯部位的LDso均小于1000／_g／ml，尤其大籽猕猴桃、对萼猕猴桃分别达到468／zg／ml、426／zg／ml，具有较强的细胞毒性．方差分析表明，大耔猕猴桃和对萼猕猴桃对卤虫的LDso值无显著差异，而二者与其它猕猴桃则差异显著，表明二者的细胞毒性较强。 博士学位论文=抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究表5-2，种猕猴枕乙酸乙醇部位对卤虫的致死作用(％)(n司)Table5-2Lethalr咖订Hhy●acetatefr雄meatsfroa,nineAlct／,／d／es畔蛔蛐brineslssimpt％)I-：3)No．样品枷刚d400熘,／-,枷删叫sao坞,／ml1000朋／mlL嵋(t,g／ad)l大耔猕猴挑10舶±2．2825．564-0．7472．22±3．70船．97士5．13l∞肿±0瑚46&I‘2对荨猕猴挑7．47±1．0833．23-4-7．柏SO．45±10．4590．00-4-6．67100．00士咖426,43黑麓猕簇挑6．94±o．9327．“±8．5737．24士6．6450m±1．2557．89±411281孙4紫果猕猴挑0．00±0m加∞±1．II29．91±6．7237．蔼±2．嘶5530-4-1．31943a5异色猕猴挑n∞±0肿11．27±Z7532．60±3．9l60．19±3JD994．15±3j90649c6长叶猕猴挑0．舯±0m4．76±3．1738-0，±4．8433．60±10∞523，±4．1'782曲7毛花嚣猴槐10．09±z2823∞-_4-_9．0534．70±3_5351．55±12．1557．砷±4．93827b8小叶猕猴槐833±0肿15．13±1．∞20勰±3j9929．91：k4．5633．33士5．56>10009中华猕猴槐IO岛土O_569．09±0．0029．24±11．16柏．65"4-2．5343．33±6．67>100010鬼臼毒素．一．”‘显著水平‘5％(5％significant)5．2．3体外肿瘤细胞抑制试验9种猕猴桃乙酸乙酯部位对3种肿瘤细胞的抑制作用见表5-3。结果表明，大耔猕猴桃对供试的3种肿瘤细胞株均有较强的抑制作用．但敏感性存在差异，抑制效果为SMMC-7221>SGC-7901>A549。大籽猕猴桃对人肝癌细胞株SMMC-7221的ICso为54．22|Jug／ml，而对萼猕猴桃仅为217．85pg／ml，抑制效果远远差于大耔猕猴桃．紫果猕猴桃的抗肝癌活性略低于大籽猕猴桃，其它供试材料如异色猕猴桃、长叶猕猴桃、毛花猕猴、小叶猕猴桃桃对SMMC的抑制效果均显著优于大籽猕猴桃，尤其是小叶猕猴桃的IC∞达到6．53#g／ml，活性相当于大籽猕猴桃的8倍。另外，大籽猕猴桃的常见混用品黑蕊猕猴桃和中华猕猴桃的IC钟均大于243#g／mr，对肝癌细胞的抑制活性较低。在人胃癌细胞株SGC-7901、人肺癌细胞株A549体外抑制试验中，9种供试材料仅大耔猕猴桃和对萼猕猴桃有较强的抑制作用，二者对SGC-7901的IC∞分别为133．16#g／ml、136．46／Yg／ml，对A549的ICso分别为206．63#g／mr、224．83／zg／ml，两组活性相当，差异均不显著。其它7种猕猴桃的IC蜘均远大于243∥g／ml，抑制活性较低。77 博士学位论文：抗肿窟中草药猫人参的神质鉴荆及其与近缘种的活性比较研究表5-3，种猕猴槐乙酸z‘醋部位对3种肿稽细臆株生长的抑制作用(％)(B3)Table5-3lolu'bitioarateof枷叫acetatefragmentsfromnlrmeActinidi口spcdbon3tumorcell-jn嚣‘％)佃--．3)5异色猕猴桃0j3l33．97±o．7320．“±3．0225．50±433-S．45±O．978．23±2．018．46±1．76O．S4±01032．16±0．234．94±0．76 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缭种的活性比较研究lO阿霉素0．582．0564．1354．43 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究5．3讨论卤虫毒性模型(brineshrimplethality箍翰v)是Meyerclal(1982)建立的用于筛选具有药理活性物质的一个快速、方便和廉价的方法。该模型被认为是总体毒性(generaltoxicity)初步评价的有力工具，其分析结果与入肿瘤细胞毒活性分析或杀虫分析一致性较高(McLaughlinctal，1991)。SoILetal(1993)研究了21种对KB细胞有细胞毒作用的化合物，除了2种化合物需在人体内代谢才能发挥作用外，其余19种都可被卤虫模型可靠地检测。因此，该毒性模型应用较广泛，往往用其进行总体毒性评价后，再用抗肿瘤细胞(Costa-Lotufoetal，2005)、抗真菌(Ajaiyeobaetal，2003；MosMctaI，2(105)、抗细菌(Ajaiyeobaetal，2003；Kumarasamyctag2003；Moshictal，2005)、抗昆虫幼虫(U棚一Bullaetal，2004；Lunact“，2005)、抗软体动物(Lunactal,2005)、抗疟原虫(Wanyoikeetal，2004)、抗蛇毒(Adzu，2005)等模型检测具体毒性。但鉴于卤虫是活生物体，其作用靶点较多，除了细胞毒物质之外，神经毒等其它物质也可对卤虫起作用，所以卤虫模型并不能专一性地筛选具有抗肿瘤活性的物质。当我们寻找抗肿瘤的活性物质时，有必要配合选择性更强的方法。在这方面，细胞毒吖rr法具有较高的互补性．在抗肿瘤物质的筛选中，M'IT法由于采用瘤株直接为细胞毒物质为指示细胞，具有敏感性强、筛选结果与体内相关性好等优点。张亚妮(2005)研究了猫人参有效部位对不同肿瘤细胞抑制作用，猫人参葱醌类和皂苷类分离物对不同肿瘤细胞的IC钿(弘∥mI)分别为：自血病K562(20．加、39．31)、肝癌SMMC-7221(64．51、65j吁)、肝癌BEC-7402(113．08、159．12)、胰腺癌Bxpc-3(73．09、111．52)、乳腺癌MCF-7(89．77、86．86)、肺癌SPC-A-1(38．05、141．86)、卵巢癌H0．8910(38．02、47．89)、子宫癌HeM(66．86、285．14)。本研究结果表明，大籽猕猴桃、对萼猕猴桃乙酸乙酯部位对卤虫的LCso最高，分别为468#g／ml、426#∥ml。MJIT法对肿瘤细胞抑制作用的检测结果显示，虽然不同细胞株对供试的有效部位敏感性不局，但总体上大耔猕猴桃和对萼猕猴桃的抑制作用较强，验证了卤虫毒性检测的结果。其中本研究大籽猕猴桃对肝癌SMMC-7221的1Cso为54．22#∥ml，活性略高于张亚妮(2005)分析的葸醌(64．51飑／m1)和皂苷类化合物(65．27∥∥m1)，而对萼猕猴桃的活性(217．85pg／m1)则远低于这两类分离物。两种毒性模型的数据表明，大耔猕猴桃和对萼猕猴桃具有较强的细胞毒性．说明其临床用于抗肿瘤治疗是有药理学依据的。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究本文所选取的试验材料为9种猕猴桃的乙酸乙酯分离部位，所含成分应较复杂，但HPLC图谱显示的吸收峰并不丰富，而且保留时间较小的吸收峰分离度较差，这与HPLC的洗脱系统和洗脱时间有很大关系，需要进一步改进洗脱条件以完善谱图，更加真实地表现乙酸乙酯部位的成分．张亚妮(2005)认为，猫人参中具有抗肿瘤作用的成分并不是单一的，在葸醌和皂苷两个部位中互有交叉，作用靶点不尽相同。虽然本研究中HPLC图谱仍需进一步完善，但从本研究初步结果看，虽然9种猕猴桃有效部位HPLC图谱中峰面积最大的3个峰(保留时问10-12min)为共有峰且面积差异不显著，但是9种猕猴桃的对卤虫和肿瘤细胞的毒性差异较大，表明这3个最高含量的化合物可能并不是具细胞毒作用的化合物，而HPLC图谱中未检测出明显吸收峰所代表的化合物则有可能时有效物质群，分离、浓缩该部位将大大提高猫人参的抗肿瘤活性。通过多批次猫人参取样，加大有效物质群色谱族的权重，而降低对药效几乎无贡献的色谱族的权重，将有望建立体现抗肿瘤疗效的色谱指纹图谱，从而更科学地评价猫人参的质量。猫人参葸醌和皂苷类化合物对9种肿瘤细胞的抑制试验结果表明，不同肿瘤细胞对同一类分离物的敏感性有所差异(张亚妮，2005)。本研究中不同猕猴桃的有效部位对3种肿瘤细胞株作用也表明了类似情况。除了肿瘤细胞本身的敏感性差异外，抑制活性差异可能与有效部位中起抑制作用的活性物质(群)不同有关．由于猫人参有效部位对不同肿瘤细胞的抑制活性存在异同，所以在扩大猫人参药源的选择上是必须有所不同的。肝癌细胞抑制作用结果验证了富阳中草医认为“白货”对萼猕猴桃药效不及“红货”大耔猕猴桃，须加倍使用的说法，因此对萼猕猴桃不宜作为大秆猕猴桃的替代品，如果代大籽猕猴桃入药则必需加大用量才可达到同等疗效，活性偏低的黑蕊猕猴桃和中华猕猴桃则更不宜混用．而异色猕猴桃、长叶猕猴桃，毛花猕猴桃的抗肝癌效果超过大籽猕猴桃，有望作为猫人参的替代品，尤其小叶猕猴桃的抗肝癌潜力更值得关注和进一步研究开发。胃癌，肺癌抑制实验表明，对这两种肿瘤细胞的抑制作用可能是大籽猕猴桃和对萼猕猴桃所特有，二者均可以作猫人参入药，而其它猕猴桃种类的活性偏低，不宜混用，否则可能无法达到预期疗效。8l 博士学位论文：抗肿瘸中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种台勺活性比较研究第六章9种猕猴桃生药材矿质元素的比较矿质元素(无机元素)包括微量元素与宏量元素，微量元素又分必需元素、非必需元素、有害元素。目前，公认的必需元素有Mn、Fe、Co、Zn、Cu、Ni，Mo、I、v、cr、F’Sr、Se、Sn，非必需元素有Si、B、Rb、As、Al、Ba、币、Nb、Zr等，有害元素有Hg、Pb、Bi、Sb、Be、Cd等(Williams，1984)．中医理论认为，中药的疗效来自中药的基本性能——其性味、功效、趋向(升，降、浮、沉)及归经。随着现代科学技术的发展，不断揭示了中药的气味是有物质基础的，它包括两大体系：一是有效成分，二是微量元素．近年来，对中药材微量元素已作了一些研究，并揭示了微量元素在中药功效中确实占有一定的地位。曾成呜和孙凡(1995)发现芦丁对癌细胞无杀伤作用，CuS04溶液对癌细胞仅有轻微杀伤作用，但芦丁铜(II)配合物的杀伤作用却很强。对黄芩苷金属配合物的研究表明，黄芩苷锌的抗炎，抗变态反应作用均强于黄芩苷(李延峰，1999)。祁俊生等(1998；2003)测定了110首方剂煎煮液中33种微量元素和105味植物类中药中42种微量元素含量，并应用化学计量学的因子分折和聚类分析对测定数据进行多因素分析，证明中药微量元素含量是决定中药四性的物质基础之一，提示了微量元素含量和中药疗效之间存在的相关性。中药材中微量元素含量是影响中药材质量的一个重要因素逐渐成为共识，因此有些学者认为，应该把中药材中微量元素的含量作为鉴定中药材质量的标准之一(宋维秋和李涵，1999)。微量元素与肿瘤的关系也越来越受到人们的重视，其在体内含量的变化与肿瘤的发生、发展、预防及治疗密切相关(侯震江和孟晨阳，2005)。本文测定比较了9种猕猴桃茎于生药材的矿质元素含量。以从微量元素角度探讨猫人参的抗癌疗效的化学基础，并为猫人参生药质量控制和人工种植指导提供依据。 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究6．1材料与方法6．1．1材料供试材料为2003-2004年秋冬季(10-11月)采集于各地的9种猕猴桃直径约2cm的成熟茎干(见表6-1)。凭证标本存放于浙江大学植物标本馆(HZU)．表6-1供试材料1抽k6-11．h-tofn—jed眦terlab6．1．2样品前处理用水洗去材料上的浮土杂质，再用去离子水冲洗2-3次，于60-70"C条件下烘干，分别粉碎备用。分别精确称取每样品粉末1g，各3份，放入铂金坩埚中，移入马富炉，500"C低温炭化5h，冷却后，用l：l的盐酸(优级纯)2ml溶解，移入50ml容量瓶中，溶液呈蓝绿色，用双蒸水定容至刻度，得样品溶液。同时以不加样品同前法操作得空白溶液。6．1．3测定方法检测仪器为IRIS／AP型电感耦合等离子体原子发射光谱仪(IcP．AEs)(美国TJA公司)，检测条件如下：检测器CID的低波段(<265rim)积分时间：15S检测器CID的高波段(>265nm)积分时问：5s进样蠕动泵转速：100rpm进样雾化器氩气压力：28psi辅助气流量：适中(1．0I．／min)高频发生器功率：1500w 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究样品冲洗时间：5s6．1．4统计分析将分析测得的各元素含量数据按下式标准化，或保留Cu、Fe、Se、Zn的原始值以加大权重，其它数据均按下式标准化，然后用SPSS12．0软件进行聚类分析，聚类方法为Ward'smethod(最小方差法)，距离和相似性测度方法为Euclideandistance(欧氏距离法)。数据标准化公式：Xij’=(Xij-Xj)／Six《’为标准化后的数值，x《为原始数值，Xj为9个样品某一元素含量的平均值，S§为9个样品某一元素含量的标准差。6．2结果与分析9种药用猕猴桃茎干生药的矿质元素含量见表6-2．由表可见，9种猕猴桃各矿质元素的含量总体上较接近，尤其Hg、Mo的含量均极低，可能是该属植物对矿质元素吸收的共同特性。但种问差异亦较显著，大籽猕猴桃Cu、Zn含量显著高于其它8种猕猴桃，而AI、Mg、Na、Se、Si的含量较低。长叶猕猴桃、毛花猕猴桃AI、Mn含量比其它猕猴桃高一个数量级。9种猕猴桃有害元素的累积也有异同，紫果猕猴桃、异色猕猴桃、毛花猕猴桃、小叶猕猴桃几乎不含舡，而其它种类则含As0．05--0．6／【lg／g不等，Pb含量除长叶猕猴桃显著较高外，其它8种猕猴桃的含量较接近，而9种猕猴桃Hg的含量几乎为零。矿质元素数据的层级聚类图表明(图6-1)，从矿质元素的总体分布来讲，大籽猕猴桃(1)与异色猕猴桃(5)最相似，大籽猕猴桃与对萼猕猴桃(2)的差异较大，而相同产地(江西武宁)的对萼猕猴桃与中华猕猴桃(9)则十分相似。加大Ca、Fe、Se、Zn权重后的聚类图(图6．2)显示，大籽猕猴桃(1)茎干生药材的矿质元素累积与其它8种猕猴桃均有较大差异，而黑蕊猕猴桃(3)、紫果猕猴桃(4)、对萼猕猴桃(2)、异色猕猴桃(5)总体较相似，小时猕猴桃(8)、中华猕猴桃(9)、毛花猕猴桃(7)总体也较相似，长叶猕猴桃与其它8种猕猴桃的差异最大． n寸寸q∞一n一∞薹委冬；誉≤g饔妄口a卜=口卜口¨∞是豢釜量量裹善量§n”一ooo—d6d、，V6V、，6嚣磊是#；甓警誉。璺暮孽百叠虽§蠢富罨舄与穹吊翼昱驾与葛高高高；写磊瓮2=量葛葛5qd‘寸一2导窨昌嚣最最譬高：2互至交j暑暑焉泛on．_【口寸o．InoN．∞nnt甘寸寸厶．nn∞U_【卜卜心．寸no_【．％西1．Nnoooo．v_【onN．o口noN．0_t”00．o—nA_1．o∞∞鼍Nn西N-onn2．0oN帅．Ino．n一寸ot卜霜E卜o_【6．o∞寸∞_I．ognn．0n心No．0卜卜n一'0goo．v寸∞2．0芝hN．0一∞A一．oAn噜o．0n．￡，一．∞卜nn，^厶c叶nnnt卜∞nn．_【n寸吼．寸∞寸∞．∞卜”c．西。口寸口一n．o∞Ic∞．on寸n冀on母Nton口a廿．o一∞n8．o；Hn．0喜．o啦_【西冀oNNlc寸卜N‘_Ioooo．v008．v0000．voooo．v器篷蠡释}嚣冀舔古、f，嚣《溱掣卸嚣黛舔古掣嚣蒸舔司曦嚣冀舔碟紧嚣蹩舔趣鹾嚣馨舔龄靛嚣粲蕊羹Ko∞oI^f巨霄∞n^舍toog．vn．c8麓800．vn．器onoooo．v6．ooN寸龟∞o畸N001)0．v00()0．v080．v—6'卜∞卜n．∞”∞寸唧甘”o寸．寸nn一．9∞g．口080．v_l叶∞tAAn．noooo．vn一．∞nn婚∞．峪n”N．_【口no．I∞”寸．0∞葛．c_【nN．I∞卜=．o∞o∞_【．0寸口∞．【，ono寸qono∞．【．o卜卜nl’on8I_【．o卜寸。一．o∞寸∞_【6n心n．1．o寸_【卜o．0誉nH．o∞2I．o∞08_【．on寸N_【．o∞．n_IoN∞．oo∞一∞．∞n譬∞．”∞岛_【8．¨a=∞．¨小oN∞．o卜oN∞．NgN8．n∞西一∞N∞．∞西∞o．口∞”吨a譬6．A一¨t¨o卜o．6oon．o．【嚣篷舔抖}墨冀舔苦÷嚣冀奄掣御嚣冀嚣蕾必嚣篱蒋日武嚣冀蘸睬装嚣鼙蘸璐醮嚣蒸舔肆霞纂黛藤妻K^苫3●如瓤岷《k岳摊嚣爨蒋匮鬻毒Az．崎；誊袈蠢酃芏犁蜒g毒蓊掣圩芸蹦矗鲜筐嚣g鞭、r操§垂手导嬖量螺．杈搿晕扑÷笙 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究CASE0510152025Labelh●——————————}-，———————{—————————■—————————{————，——，—+圉‘-l，种猕猴执基于矿质元素含量的聚类田(1：大耔猕猴橇，2：对萼猕猴桃，3．黑蕊猕猴桃，如紫皋猕猴枕。5=异色餮猴桃，‘．长叶猕猴挑．7：毛花猕猴横，l：小叶猕狡橇，，：中华器猴挑)脚‘lClusterdeadrogrsmofaiae枷单∞蛔basedonmineraldementsdata(1：^macrospenu,2：^m‰，3：^mdaMndra，4：正4罾血vacpurp性rea，5．丘扭￡[D脚vacd／sco／or,‘：丘k嘲d哆t眦7：^er／aatha，S：正[anceolata,，：^抽妇戚'CASE05tO152025LabelHLm{·——————————·—}-——-———-———+·——-·—————-●-———————————f———c—，——-—_+圈6-2，种猕猴挑基于矿覆元素含量的聚类图(加大Cu、Fe．&，72,捉重)(I=大耔猕猴撬，2：对萼猕猴横，3：黑蕊猕猴枕，4：紫果裤猴桃，s．异色猕猴挑。‘．长叶舜羲槐，7：毛花猕猴枕．s：小叶猕羲执。'：中华猕猴槐)Fig．6-2ClusterdendrogramofsdneAcf／n／d陆specksbasedOImineralelementsdata(increasingweight谴Cu,Ye,Se,Za)(1：^mecrosperma,2：工哺妇血，瓢^me／aaandm，4-丘删苫啦valr．purpurea,S：丘∞‰鼬·car．d／sco／or,‘：At．矗棚t吐oⅥ聃，7：丘e,-函aha，暑：^leaceol蛐，'：^chinensis，294738l563425I8g76 博士学位论文：抗肿癌中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究6．3讨论近年来有关微量元素失衡致癌机制的研究倍受重视，大量研究表明，恶性肿瘤患者往往血清锌、硒、铁降低，而铜及铜，锌比值升高(侯震江和孟晨阳，2005)。cu络台物具有抗炎、抗溃疡、抗痉挛，能抑制癌细胞的发生和生长，具有抗癌作用。zII与体内200多种酶的活性有关，是200多种酶的活性中心，因此zn不足使酶的活性下降，不仅能影响人体的衰老，而且还能导致免疫功能下降，促进癌症的发生与发展。硒的摄入与癌症发生率呈显著负相关，它通过调控肿瘤基因的表达，抑制蛋白激酶C的活性，从而抑制肿瘤细胞的增殖，降低癌症的发生(王海宏和谢忠枕，2003)。铁参与血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素氧化酶、过氧化物酶等的合成，癌变发生时半数以上的含铁酶在肝细胞内快速增殖，增加对铁的利用。本研究结果表明，大籽猕猴桃茎干生药中Cu、Zn含量较高，而Se含量较低，Fe含量中等，说明猫人参的抗肿瘤作用可能与高含量的Cu、ZII有关。通过加大具抗癌作用微量元素Cu、Fe、sc、Cu权重获得的聚类图表明，大耔猕猴挑与对萼猕猴桃、黑蕊猕猴桃、小叶猕猴桃等混用品的差异均较大，因此从抗肿瘤微量元素含量的角度，其它种类猕猴桃代用大籽猕猴桃作猫人参可能会影响疗效。植物矿质元素主要从土壤中吸收，所以植物中矿质元素的含量与土壤有直接关系；另一方面，植物对矿质元素的吸收具有选择性，不同元素在植物体内的含量差异很大，这种差异往往并不与元素在土壤中含量的差异相一致。吴忠等(2001)认为，同种药材由于具有相同的生长基因，从土壤中吸取并最终积累在药材内的元素在种类分布及含量高低上应有一定规律，即每种中药都有各自的微量元素特征谱，这种规律性可作为中药鉴定分类的依据，并已成功地利用微量元素指纹谱计算机鉴别技术鉴定了中药苦丁茶、麦冬、贝母、黄芩、细辛、三棱等的真伪，其研究结果与生药学鉴定结果完全一致。崔晓阳等(2003)对不同垂直景观带141个野生植物样品中Fe、Zn、Se、Ge含量的分析结果表明，不同植物样品中微量元素含量差异较大，差异主要来源生物性因素(种间差异、部位差异、生长期差异)，其次为生态因素(4-壤、气候)．从本章研究结果来看，9种猕猴桃基于矿质元素含量的聚类图除对萼猕猴桃(2)和中华猕猴桃(9)距离较近、相似度较高外，其它种类相互距离较远、相似度较低，因此能达到较好的区分效果。但该聚类图并不能体现供试种类的系统 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴j；町及其与近缘种的活性比较研究关系，如亲缘关系最接近的净果组大耔猕猴桃、对萼猕猴挑、黑蕊猕猴桃、紫果猕猴桃在聚类图上并没有首先相互聚到一起，而是全部先与其它组的种类聚到一起后，再彼此聚到一起，显示相互距离较远、相似度较低。同时同是浙江百山祖产的紫果猕猴桃(4)、长叶猕猴桃(6)、毛花猕猴桃(7)，江西武宁产的对萼猕猴桃(2)、黑蕊猕猴桃(3)、中华猕猴桃(9)，浙江顺溪产的异色猕猴桃(5)、小叶猕猴桃(6)并没有分别完全聚集在一起，仅江西武宁产的对萼猕猴桃(2)和中华猕猴桃(9)首先聚在一起，且距离十分接近、相似度极高．说明基于矿质元素含量的聚类图应该是生物因素和生态因素综合作用的结果。综观以矿质元素数据为分类特征的中药聚类分析报道，该方法对品质相近而产地不同的药材(如道地药材)的区分和鉴别十分有效，如化橘红(林海丹等，2002)、肉苁蓉(Cistanchedeserticola)(苏薇薇等，2003)和蛇床子(张巧艳等，2005)等的聚类分析可较好地区分和鉴别道地药材，但这些聚类图并未很好地体现供试材料之间的亲缘关系远近。因此基于矿质元素数据的聚类图可以较好地区别不同物种或不同产地的同一物种，尤其在中药等干材料的应用上尤为方便快捷，但该聚类图与样品亲缘关系的相关性较低，似乎并不适宜用于系统分类。88 博士学位论文：抗肿瘤中草药猫人参的种质鉴别及其与近缘种的活性比较研究第七章大籽猕猴桃挥发油成分及其猫草反应研究猫人参入药始于其对猫的特异性吸引作用，人们发现该植物的新鲜茎叶能引起猫的特异性嗜食，并且在猫肢体受伤时，常嚼食该植物作自我疗伤，遂命名为猫人参。类似的现象最早见于荆芥(Nepetacataria)，Todd(1962)将家猫对荆芥表现出的快速闻嗅、舔拭、咀嚼、摇头、摩擦下巴和身体等现象定义为猫草反应。迄今已在荆芥属、猕猴桃属、缬草属(Valerianaspp．)、猫麝香草(Teucriummarum)、草苁蓉(Boschniakiarossica)、睡菜(Menyanthestrifoliata)、幌菊(Nemophilamenziesii)、白鲜状牛至
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